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92次產(chǎn)品名稱:丁基-瓊脂糖凝膠 H.P.
性狀:白色微球,凝膠狀,保存在20%酒精溶液中
凝膠類型:疏水層析填料
結(jié)構(gòu)成分:6%交聯(lián)瓊脂糖
粒徑:24-44μm
工作PH值:2-14(短時間);3-12(長時間)
操作溫度:4-40℃
配基密度:40μmol/mL
保存條件:4~25℃密閉保存
應(yīng)用:疏水層析介質(zhì),高分辨率,適合生物大分子和疫苗的分離純化等。
操作步驟
1 裝柱
(1)讓所有的材料和試劑達到室溫。配制初始緩沖液(平衡液)和洗脫緩沖液。
(2)根據(jù)柱子大小取所需量的凝膠,清洗掉20%乙醇,抽干,用初始緩沖液(按凝膠:緩沖液=3:1的比例)配成勻漿。
(3)將柱內(nèi)及柱子底端用水或緩沖液潤濕并保持一小段液位(液面略高于濾膜),務(wù)必使底端無氣泡。
(4)用玻璃棒引導(dǎo)勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi),注意勿使產(chǎn)生氣泡。打開柱子出液口,使凝膠在柱內(nèi)自由沉降,連結(jié)好柱子頂端柱頭。
(5)打開蠕動泵,讓緩沖液用使用時流速的1.33倍的流速流過,使柱床穩(wěn)定。用2~3倍柱體積的緩沖液平衡柱子。
2 平衡
讓平衡緩沖液以一定流速流過柱子,到流出液電導(dǎo)和pH不變。平衡緩沖液一般是高鹽濃度的緩沖液,如0.02~0.05mol/L的PBS加1~2.5mol/L(NH4)2SO4等。
3 上樣
(1)樣品用平衡液配制,渾濁的樣品要離心和過濾后上樣。
(2)一般情況是讓目標產(chǎn)品結(jié)合在柱子上,用平衡液洗去雜質(zhì),再選擇一種洗脫液洗下目標產(chǎn)品。
(3)介質(zhì)對樣品組分吸附的程度取決于樣品的疏水性質(zhì)、流動相的離子強度和溫度。鹽濃度大、溫度高或樣品組分疏水性強,介質(zhì)對組分吸附牢。
4 洗脫
疏水介質(zhì)可用減小鹽濃度進行洗脫。加表面活性劑或有機溶劑可加強洗脫。最chang用的洗脫液是低鹽濃度緩沖液,如0.02~0.05mol/L的PBS。
5 再生
一般用低鹽濃度的緩沖液洗,洗10倍以上柱體積,接著用結(jié)合蛋白的平衡液洗到平衡,可再次使用。
若有失活蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)在再生時洗不掉,可用在位清洗(CIP)除去。
6 在位清洗
(1)對于以離子鍵結(jié)合上去的蛋白,可以用2M Nacl去除。
(2)對沉淀蛋白、對以疏水性結(jié)合的蛋白或脂類,可用1M NaOH 去除。
(3)對強疏水性結(jié)合的蛋白、脂類等,用4~10倍柱體積的70%乙醇或30%異丙醇清洗,但要注意有機溶劑的濃度以梯度的方式逐漸增加,否則容易產(chǎn)生氣泡。
清洗完畢后,用至少3倍緩沖液平衡柱子。
7 注意
在裝柱、使用和保存柱子的時候,要避免柱子流干,氣泡進入。
8 去熱源
用0.5M的氫氧化鈉清洗柱子5~6小時或用0.1M的氫氧化鈉24小時?;蛴靡韵路椒ú襟E去除:
(1)2倍柱體積的70%乙醇;
(2)2倍柱體積50mM Tris-Hcl pH5;
(3)1倍柱體積4M尿素;
(4)3倍柱體積的Tris緩沖液+0.1M Nacl;
上緩沖液都在無熱源的雙蒸水中配制。
9 消毒 用0.5~1M NaOH室溫下洗8~10倍柱體積,初始緩沖液平衡柱子。
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