中文名稱：Western及IP細(xì)胞裂解液
分    類：蛋白提取
規(guī)    格：100ml
保存條件：—20℃,12個(gè)月
用    途：裂解細(xì)胞提取總蛋白質(zhì),主要用于Western,免疫沉淀,免疫共沉淀等
注意事項(xiàng)：主要由Tris 、NaCl、Triton X-100組成。含有一支1.5ml PMSF。

簡(jiǎn)介：
多種成分均可以從細(xì)胞中提取總蛋白，如Triton、SDS、NP-40等。Western及IP細(xì)胞裂解液是采用一種非變性裂解方法來裂解細(xì)胞，并獲得總蛋白的裂解液。所獲得的蛋白質(zhì)可以用于PAGE電泳，Western，免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等，主要由Tris-HCl、NaCl、低濃度Triton X-100，低濃度sodium pyrophosphate等組成，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

用Western及IP細(xì)胞裂解液得到的蛋白，可以用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由于含有較高濃度的Triton X-100等干擾物質(zhì)，不宜用Bradford法測(cè)定由Western及IP細(xì)胞裂解液獲得樣本的蛋白濃度。

操作步驟(僅供參考)：
(一)貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
1、 取Western及IP細(xì)胞裂解液置于室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度。
2、 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用PBS、NS或無血清培養(yǎng)液清洗，低速離心，棄上清，留取沉淀。
3、 每孔加入含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP細(xì)胞裂解液。移液器輕輕吹打，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液作用于細(xì)胞1～5s內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)被裂解。
4、 離心(如果用冷凍離心機(jī)4℃離心效果更佳)，取上清。
5、 進(jìn)行后續(xù)的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

(二)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞
1、 取Western及IP細(xì)胞裂解液置于室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。
2、 低速離心懸浮細(xì)胞，棄上清，收集沉淀。
3、 用手指輕彈細(xì)胞，使其松散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入含有PMSF的裂解液的比例，加入Western及IP細(xì)胞裂解液。通常6孔板每孔細(xì)胞加入裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。
4、 離心 (如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。
5、 進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀等操作。

(三)組織樣本
1、 取Western及IP細(xì)胞裂解液置于室溫溶解混勻，加入PMSF，使PMSF終濃度為1mM。
2、 把組織剪切成細(xì)小的碎片，越小越好。
3、 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍以上的組織，迅速用液氮研磨，研磨過程盡量控制，以減少蛋白的降解。
4、 按照組織加入裂解液，加入含有PMSF的裂解液。裂解。
5、 步驟3、4亦可以采用如下過程：按照每20mg組織加入裂解液的比例加入含有PMSF的Western及IP細(xì)胞裂解液。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿，直至充分裂解，過程盡量控制，以減少蛋白的降解。
6、 按照每組織加入裂解液的比例，加入含有PMSF的裂解液。
7、 離心 (如無低溫離心機(jī)，室溫下離心亦可)，取上清。
8、 進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。  

注意事項(xiàng)：
1、 去除貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液時(shí)，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。
2、 如果裂解不充分可以適當(dāng)增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。
3、 如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50～100萬細(xì)胞/離心管，然后再裂解。大團(tuán)的細(xì)胞較難裂解充分，而少量的細(xì)胞由于裂解液容易和細(xì)胞充分接觸，相對(duì)比較容易裂解充分。
4、 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈Vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。