產(chǎn)品名稱:第一鏈cDNA合成試劑盒
英文名稱:RT EasyTM（For first-strand cDNA synthesis）
產(chǎn)品規(guī)格:25 rxns 100 rxns
產(chǎn)品貨號:RT-01011
保存說明:短期室溫，長期2-8℃
產(chǎn)品描述:用于長cDNA合成或者客戶特定引物RT反應(yīng)

英文名稱:RT EasyTM（First-strand cDNA for Real Time PCR）
產(chǎn)品規(guī)格:50 rxns 200 rxns
產(chǎn)品貨號:RT-01021
產(chǎn)品描述:第一鏈合成，添加2種引物，用于Real Time PCR

第一鏈cDNA合成試劑盒 注意事項:
1、確保RNA完整性及純度。RNA質(zhì)量是決定合成cDNA第一鏈成功的關(guān)鍵因素,其純度及完整性可由OD260/OD280比值和進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。較純的RNA樣品OD260/OD280比值通常為1.8-2.0,若該比值偏低,應(yīng)進一步純化。真核生物RNA樣品電泳圖譜28s和18s的比值約為2:1,否則,表明有RNA降解。
2、避免RNA酶污染。進行cDNA合成所用的器皿、試劑和溶液必須*無菌。操作過程始終戴手套以杜絕各種RNA酶的污染。
3、 合成cDNA第一鏈的引物選擇。選擇oligo(dT)12-18作為反轉(zhuǎn)錄引物,可保證cDNA具有完整的3’-端,通?？傻玫浇咏L的cDNA第一鏈;若選擇隨機寡核苷酸(dN)6或(dN)9作為引物,引物在整個mRNA的多個位點退火,產(chǎn)生短的部分長度的cDNA第一鏈。這種方法經(jīng)常用于獲得5’末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。

第一鏈cDNA合成試劑盒 操作方法:
1、 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
(1) 在無菌薄壁管中加入以下成份:
Total RNA   0.5-1.0µg
(dN)9 or oligo(dT)18  100pmol
(2) 混勻后,70℃變性5min,將薄壁管迅速置于冰上冷卻,然后依次加入以下成份:
5×M-MLV Buffer 4µl
dNTPs(10mM each) 1µl
RNasin 10U
100mM DTT 2µl
M-MLV Reverse Transcriptase 100U
DEPC-treated water up to 20µl
（3） 混勻后短暫離心，使用oligo(dT)18引物時在42℃，使用隨機引物(dN)9時在37℃下溫育1小時。
(4) 94℃ 5min終止反應(yīng)后,冰上冷卻。
(5) 合成的cDNA第一鏈可直接用于PCR擴增或進行其它下游操作。

2、 PCR擴增
(1) 在PCR薄壁管中加入以下試劑
Synthesized cDNA 2-5µl
10×PCR Buffer 2µl
Upper primer 10pmol
Lower primer 10pmol
dNTPs(10mM each) 0.5µl
Taq DNA Polymerase 1.5U
ddH2O up to 20µl
(2) 混勻后短暫離心,然后進行PCR擴增。
94℃預(yù)變性2.5min。進入下列30~40個循環(huán)(此擴增條件僅供參考):94℃30s,60℃ 45s,72℃ 1min~3min。后72℃延伸7min。

第一鏈cDNA合成試劑盒 常見問題及參考意見

1、cDNA產(chǎn)量很低,為什么?
可能的原因：
(1)RNA模板質(zhì)量低；
(2)對mRNA濃度估計過高；
(3)反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足；
(4)反應(yīng)體積過大，一般不應(yīng)超過50µl。

2、合成不了長鏈的cDNA,為什么?
(1) RNA降解。對使用的器具、試劑用DEPC、干熱或濕熱滅菌處理，以杜絕RNase污染。同時，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入RNase抑制劑。
(2) 反應(yīng)條件不合適。通過預(yù)實驗確定合適的反應(yīng)條件，包括酶量、鹽濃度、反應(yīng)溫度（37~56℃）、DTT濃度（0.5~10mM）。
(3) RNA結(jié)構(gòu)問題。提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，或者使用隨機引物。