1 基本原理

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域zui基本的技術(shù)。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改變物種的遺傳性狀,從而獲得新的品種或產(chǎn)品,則是包括基因工程在內(nèi)的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的主要研發(fā)內(nèi)容。

在下面的小實(shí)驗(yàn)中,我們將通過基因轉(zhuǎn)化的方法,把一種對氨芐青霉素敏感的大腸桿菌轉(zhuǎn)化成能抵抗氨芐青霉素的大腸桿菌。其基本原理是:細(xì)菌中存在一種環(huán)狀DNA,叫做質(zhì)粒,它可以作為載體把外源基因(比如動物或植物的基因)攜帶到細(xì)菌中進(jìn)行表達(dá)。如果它攜帶了抗氨芐青霉素的基因,那么被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌就獲得了抗氨芐青霉素的遺傳性狀,這樣原來不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌也能在其中生長了。

一般情況下,往往把要在大腸桿菌中表達(dá)的外源基因插入在含有青霉素抗性的質(zhì)粒中,以便于篩選出轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。

2 實(shí)驗(yàn)材料

1)感受態(tài)大腸桿菌(制備方法見附錄一)。

2)含有抗氨芐青霉素基因的質(zhì)粒(制備方法見附錄二)。

3)含有氨芐青霉素的細(xì)菌固體培養(yǎng)基板(制備方法見附錄三)。

4)其他試劑:不含抗生素的細(xì)菌液體培養(yǎng)基(制備方法見附錄三)。

5)器具:1.5mL的塑料離心管、1mL的吸量管、滴管和橡膠吸頭、水浴鍋、碎冰塊、小型離心機(jī)、培養(yǎng)皿、涂布棒、接種環(huán)、高壓滅菌鍋、酒精燈、溫度計、酒精棉球、超凈工作臺(視條件而定,如房間干凈,也可直接在實(shí)驗(yàn)臺上操作)。

3 基本步驟

1)在無菌條件下(酒精燈旁),向盛有50~100μL感受態(tài)大腸桿菌的塑料離心管中加入2μL質(zhì)粒(濃度為1ng/μL),用滴管輕輕抽吸使之混合均勻,在冰上放置30min。

2)將離心管放入42℃水浴中熱激90s(此處需準(zhǔn)確計時),然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上,放置1~2min。

3)每管加入500LL無抗生素的細(xì)菌液體培養(yǎng)基,在37℃搖床以200r/min的轉(zhuǎn)速振搖1h,也可用手每隔幾分鐘顛倒離心管幾次。

4)將離心管放入小型離心機(jī),以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,用吸量管吸去部分上清液,使離心管中的剩余液體約為100μL,然后用滴管輕輕抽吸離心管中的剩余液體,使沉淀在管底的細(xì)菌重新懸浮在液體中。用吸量管吸取這些細(xì)菌的懸浮液,放到含有氨芐青霉素的細(xì)菌固體培養(yǎng)基板上,用涂布棒將細(xì)菌懸浮液涂布均勻,蓋上培養(yǎng)皿,放置5min。

5)用與步驟4)相同的方法將沒有加入質(zhì)粒的感受態(tài)大腸桿菌涂布在另一塊含有氨芐青霉素的細(xì)菌固體培養(yǎng)基板上。對兩塊平板要分別做好標(biāo)記。

6)倒置培養(yǎng)基板,在37℃下培養(yǎng)12~16h。

7)觀察培養(yǎng)基板,比較上面生長的菌落數(shù)目。一般情況下,1ng質(zhì)?？色@得1000個轉(zhuǎn)化的細(xì)菌克隆(菌落)。

4 注意事項(xiàng)

1)操作之前應(yīng)該洗手,然后用酒精棉球擦手。

2)實(shí)驗(yàn)中使用的器具應(yīng)高壓滅菌。

3)每一步操作都要注意無菌,在無菌操作臺內(nèi)的酒精燈火焰附近進(jìn)行操作。

附錄一 制備感受態(tài)大腸桿菌

1)從在37℃下培養(yǎng)了16~20h的新鮮平板上挑取1個單菌落,接種于5mL液體LB(LuriaBeriani)培養(yǎng)基中,在37℃的搖床中振搖培養(yǎng)12h后,按1∶100比例轉(zhuǎn)接于20mL液體LB中,37℃振搖培養(yǎng)至對數(shù)中期(約3h)。

2)將菌液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中,在冰上放置10min。

3)在4℃下,以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,棄上清,加入原菌液13體積的用冰預(yù)冷的0.1molCaCl2溶液懸浮菌體,在冰上放置30min。

4)在4℃下,以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min,棄上清,加入原菌液112體積和用冰預(yù)冷的0.1mol

CaCl2溶液,懸浮菌體,在冰上放置10min。

做好的感受態(tài)細(xì)胞可立即用于轉(zhuǎn)化,也可存于4℃冰箱,于1周內(nèi)使用;或者加入20%體積的無菌甘油,存于-70℃超低溫冰箱備用。

附錄二 堿裂解法提取質(zhì)粒

1)將2mL含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基加入15mL的試管中,接入單菌落,在37℃下,以200r/min的轉(zhuǎn)速振搖培養(yǎng)過夜。

2)將1.5mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入小塑料離心管中,離心棄去上清液。

3)向離心管中加入100μL在冰上預(yù)先冷卻的溶液Ⅰ,劇烈振蕩,使細(xì)菌沉淀和溶液Ⅰ混勻。

溶液Ⅰ:50mmol葡萄糖

10mmolEDTA(pH8.0)

25mmolTris·HCl(pH8.0)

4)加入200μL新配制的溶液Ⅱ,蓋緊離心管,迅速顛倒4~5次,在冰上放置5min。

溶液Ⅱ:0.2molNaOH

1%SDS

5)加入150μL預(yù)冷溶液Ⅲ,蓋緊離心管,顛倒混勻,冰上放置10min。

溶液Ⅲ(100mL):5mol/L乙酸鉀60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

6)將離心管放入小型離心機(jī),高速離心后將上清液抽取到另一個干凈的小塑料離心管中。

7)向離心管中加入等體積氯仿(450μL),劇烈振蕩使上清液與氯仿混合成乳濁液,以12000r/min轉(zhuǎn)速離心10min。

8)離心后將上清液抽取到另一個干凈的小塑料離心管中,向上清液中加入2倍體積的無水乙醇,在4℃下沉淀20min,或在-20℃下沉淀10min,然后以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min。

9)棄上清,向離心管中加入1mL70%酒精洗滌沉淀,棄去酒精后將沉淀晾干或用真空泵抽干。

10)用50μL含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/mL)的無菌純水溶解沉淀,存于-20℃。對質(zhì)粒作酶切,電泳分析進(jìn)行鑒定。

附錄三 細(xì)菌培養(yǎng)基制備方法

1) 液體LB培養(yǎng)基(Luria-Bertani)

配制每升培養(yǎng)基,應(yīng)在950mL蒸餾水中加入:

胰蛋白胨(bacto-trytone) 10g

酵母提取物(bacto-yeastextract) 5g

NaCl 10g

振蕩容器直至溶質(zhì)*溶解,用5molLNaOH(約02mL)調(diào)節(jié)pH值至7.0,加入蒸餾水至總體積為1L,在15lbf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌2min。

如果需要加入抗生素,須在滅菌后待溫度降至50℃以下時在超凈臺中加入無菌的抗生素。

2)含有瓊脂的培養(yǎng)基(鋪制平板用)

高壓滅菌后前向前述的液體LB培養(yǎng)基中加入細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂(bacto-agar)15gL,在15lbf/in2(1.034×105Pa)高壓下蒸汽滅菌20min。從高壓滅菌鍋中取出培養(yǎng)基時輕輕振搖以混勻液體,當(dāng)心液體過熱旋動可能會發(fā)生暴沸。當(dāng)培養(yǎng)基溫度降至50℃左右時,在超凈臺中加入無菌的抗生素并旋動混勻培養(yǎng)基,避免產(chǎn)生氣泡。然后直接從燒瓶中把培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿應(yīng)事先高壓滅菌,90mm直徑的培養(yǎng)皿約需30mL培養(yǎng)基。

將培養(yǎng)基在超凈臺中吹至*凝固后,倒置儲存于4℃冰箱中備用。

說明:

1)感受態(tài)細(xì)菌也可按比例大量制備,然后分裝在0.5mL的塑料離心管中(每管50~100mL,如不考慮轉(zhuǎn)化率,減少實(shí)驗(yàn)成本,感受態(tài)細(xì)菌用量可減少一半或更少一些),如果近期內(nèi)便用,也可貯存在-20℃冰箱中。

2)感受態(tài)細(xì)菌和質(zhì)粒均可向附近的科研單位索取或從生物試劑公司購置,實(shí)驗(yàn)材料成本每人每次約5元。

3)考慮該實(shí)驗(yàn)是生命科學(xué)研究和生物技術(shù)中zui基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù),開設(shè)這一實(shí)驗(yàn)課的難度不大,成功率高,操作中很多步驟還可以簡化。