PCR(Polymerase Chain Reaction )是一種在體外特異的擴(kuò)增基因的技術(shù)。由Kary.Mullis發(fā)明，該技術(shù)大大推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展，被認(rèn)為是分子生物學(xué)發(fā)展的里程碑。Kary.Mullis分享了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。
復(fù)習(xí)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件和過(guò)程。

一、目的
1：學(xué)習(xí)PCR技術(shù)的基本原理
2：掌握從全血中制備DNA的方法‘
3：掌握應(yīng)用pcr擴(kuò)增Hbβ基因的基本操作
4：熟悉Hb基因結(jié)構(gòu)

二、原理
1：PCR擴(kuò)增的原理
聚合酶鏈反應(yīng)—PCR是一種體外基因擴(kuò)增技術(shù)，是在引物和四種脫氧核苷三磷酸存在下，利用DNA 聚合酶反復(fù)作用，使微量的特定片段得以大量擴(kuò)增的反應(yīng)過(guò)程。
PCR所需的條件：模板
引物：決定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性
dNTPs
Taq聚合酶
Mg2+
PCR反應(yīng)過(guò)程

每三步為一個(gè)循環(huán)，每循環(huán)一次，使模板DNA拷貝數(shù)增加1倍，理論上講，30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增產(chǎn)物為230拷貝
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增Hbβ基因
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增Hbβ基因上400bp片段
引物序列為 A：5′-AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC- 3′
B：5′-TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC- 3′
3：PCR產(chǎn)物的鑒定
含溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳
DNA在pH8.0電泳緩沖液環(huán)境下帶負(fù)電荷，向陽(yáng)極移動(dòng)。DNA分子量大小及形狀不同，電泳速度不同。在分子形狀相同的條件下，分子量（bp數(shù)）越大，電泳速度越慢；分子量（bp數(shù)）越小，電泳速度越快；分子量（bp數(shù)）相同，電泳速度相同。所以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以根據(jù)分子量（bp數(shù)）的大小進(jìn)行分離。bp數(shù)相同的DNA集中在同一位置上，與EB結(jié)合成復(fù)合物，在紫外燈激發(fā)下，發(fā)出桔紅色的熒光，而形成桔紅色的區(qū)帶，根據(jù)Maker判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。
三、儀器與試劑
（一）主要儀器：PCR儀 潛水式電泳儀 微量移液器 臺(tái)式高速離心機(jī)
（二） 試劑：裂解液（Tris-HCl TritonX-100） 生理鹽水 雙蒸水
PCR反應(yīng)液 液體石蠟 載樣緩沖液 電泳緩沖液
四、方法
（一）模板的制備
裂解細(xì)胞膜 1：用刻度離心管取全血0.5ml，加裂解液至3ml，顛倒混勻，振蕩60～80次。3,000rpm離心10分鐘。
去血紅素 2：棄上清，加生理鹽水至3ml，振蕩直至沉淀成線狀，3,000rpm離心10分鐘。
3：重復(fù)步驟2一次
破壞細(xì)胞核膜 4：棄上清，離心管倒置在濾紙上控干，加ddH2O 50μl,用槍頭攪動(dòng)沉淀，直至沉淀*溶解。
去除蛋白質(zhì) 5：全部轉(zhuǎn)移至1.5ml 離心 管，沸水鍋中煮沸10分鐘，12,000rpm離心5分鐘，上清液即含有模板DNA。