中文名稱：3D細(xì)胞培養(yǎng)凝膠試劑盒生產(chǎn)*
英文名稱：3D cell culture Kit
貨號(hào)：KC7186
保存條件：室溫
3D細(xì)胞培養(yǎng)凝膠試劑盒生產(chǎn)*概述
本品為生物活性凝膠，通過模擬活體內(nèi)三維組織的微環(huán)境和形態(tài)結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的體外培養(yǎng)以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供類似體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的三維立體微環(huán)境，支持各種細(xì)胞的三維生長(zhǎng)。產(chǎn)品主要成分為多糖和人工多肽，不含抗原物質(zhì)和動(dòng)物源性成分，無(wú)免疫原性，產(chǎn)品穩(wěn)定成分明確，
批次間差異小，實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性高，易于操作，僅需室溫操作，無(wú)需在冰上進(jìn)行，本產(chǎn)品可以直接使用，無(wú)需稀釋或額外添加其他成分，僅需 2 步，孵育 5-10 min 即可形成細(xì)胞-凝膠的三維結(jié)構(gòu)，凝膠剪切力敏感，可直接進(jìn)行體內(nèi)原位注射，無(wú)縫對(duì)接體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)（與細(xì)胞混合
或者不混合均可），開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞可回收培養(yǎng)，附贈(zèng)溫和裂解液，裂解或降解后的成分為單糖和氨基酸，對(duì)細(xì)胞無(wú)影響。高透光性，高通透性，方便實(shí)時(shí)跟蹤觀察，可熒光觀察、顯色觀察等。
說(shuō)明書
操作說(shuō)明：
1 使用前，將凝膠液預(yù)熱至 37℃。
2 在離心管中將凝膠液和細(xì)胞懸液輕輕混勻，可輕柔快速斡旋 1 秒鐘，重復(fù) 1-2 次。注：凝
膠和細(xì)胞混合時(shí)，必須嚴(yán)格按照說(shuō)明書，先吸取凝膠，再往凝膠中加細(xì)胞懸液，混勻，順序
不可顛倒。斡旋時(shí)間不能超過 1 秒鐘，斡旋次數(shù)不能超過 3 次，過度斡旋會(huì)破壞細(xì)胞膜并增
加凝膠中的氣泡，從而影響細(xì)胞培養(yǎng)效果。建議的終細(xì)胞濃度為 4.2x10^5/ml-1x10^6/ml。
不同的培養(yǎng)體系請(qǐng)參照下表：
孔板 凝膠液體積 細(xì)胞懸液體積 培養(yǎng)基體積
96孔板 30ul/孔 30ul/孔 80ul/孔
24孔板 150ul/孔 150ul/孔 400ul/孔
12孔板 300ul/孔 300ul/孔 800ul/孔
6孔板 600ul/孔 600ul/孔 1600ul/孔
3 用 1xpbs 潤(rùn)洗細(xì)胞培養(yǎng)板，然后快速貼壁加入凝膠細(xì)胞混合物，并于四周輕輕晃動(dòng)，使凝
膠細(xì)胞混合物均勻鋪展。注：建議至少在凝膠形成之前 20 分鐘潤(rùn)洗細(xì)胞培養(yǎng)板。
4 37℃孵育 5-30 分鐘以形成凝膠。
5 孵育完成后，沿孔壁加入培養(yǎng)液。37℃，5%CO2 條件下培養(yǎng) 24 小時(shí)。注：此期間避免晃
動(dòng)培養(yǎng)板，以免破壞凝膠結(jié)構(gòu)。
6 24 h后進(jìn)行半換液（用移液槍輕輕吸取上層細(xì)胞培養(yǎng)液的1/2，再添加等量的新鮮培養(yǎng)液），
此后可正常換液。注意：*換液時(shí)一定要緊貼培養(yǎng)孔壁，小心吸取，避免吸掉剛貼附好的
細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問題和解決方法：運(yùn)輸過程若出現(xiàn)氣泡，放置在 4 ℃冰箱，可自行消除，
如需快速消除，可微波加熱 30s。為避免使用過程中氣泡的產(chǎn)生，建議使用 1mL *
（去針頭使用）輕吸凝膠注入 EP 管中，也可用 PBS 潤(rùn)洗的 1 mL 槍頭吸取凝膠，再將細(xì)胞懸
液加入后上下輕輕吹打即可混勻。2D 培養(yǎng)的細(xì)胞接種到凝膠中，需要 2-4 天適應(yīng)凝膠的三
維環(huán)境，期間細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)可能會(huì)比較保守（呈圓形）。之后，細(xì)胞即正常生長(zhǎng)，可進(jìn)行后
續(xù)實(shí)驗(yàn)。為避免一些類型的細(xì)胞會(huì)從凝膠中遷移到培養(yǎng)皿底部貼壁，鋪板前先將孔板包被一
層薄薄的凝膠，即可解決問題。具體方法為：將凝膠和培養(yǎng)液體積 1:1 配置，鋪在孔板底
部，待凝固之后，再鋪凝膠細(xì)胞混合液。
細(xì)胞收集與再培養(yǎng)
回收凝膠中的細(xì)胞：
棄掉培養(yǎng)液，并用裂解液沖洗，加入凝膠液 5 倍體積的裂解液，輕輕吹打數(shù)次，室溫裂解約
10 分鐘，使凝膠*變成液體狀態(tài)，將混合液收集到離心管中，用 pbs 沖洗孔板并將收集
*述離心管中，1500 rpm 離心，3 min，即可收集到細(xì)胞。如果細(xì)胞在凝膠內(nèi)是成團(tuán)生長(zhǎng)
的，可以在裂解時(shí)候加大裂解液體積，延長(zhǎng)裂解時(shí)間以得到分散的單個(gè)細(xì)胞。
問題集：
1 3D細(xì)胞培養(yǎng)后如何染色？
答：3D細(xì)胞培養(yǎng)后可以直接在膠中進(jìn)行染色，染色步驟同2D培養(yǎng)的細(xì)胞。不需要進(jìn)行特殊處理。
2 3D細(xì)胞培養(yǎng)后怎么觀察？
答：3D細(xì)胞培養(yǎng)后可以使用Confocal或者熒光倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，光學(xué)顯微鏡也可以觀察，但是由于凝膠是立體結(jié)構(gòu)，可能光學(xué)顯微鏡觀察的效果不會(huì)太理想。
3 你們的3D細(xì)胞培養(yǎng)凝膠能進(jìn)行*培養(yǎng)嗎？
答：可以。
4 你們的3D細(xì)胞培養(yǎng)凝膠使用時(shí)需要使用配套的耗材或者儀器嗎？
答：不需要使用耗材和儀器。采用本試劑盒進(jìn)行3D細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所用的耗材和儀器同2D培養(yǎng)。
5 你們的3D細(xì)胞培養(yǎng)凝膠試劑盒可以用于細(xì)胞共培養(yǎng)嗎？
答：可以進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)。
6 你們的3D培養(yǎng)凝膠試劑盒是不是只能培養(yǎng)特定的一些細(xì)胞？
答：本試劑盒對(duì)細(xì)胞沒有選擇性，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞都是適用的。
7 你們的3D培養(yǎng)凝膠試劑盒和Matrigel基質(zhì)膠有何不同？
答：Matrigel基質(zhì)膠主要是由層粘連蛋白,Ⅳ型膠原,巢蛋白,硫酸肝素糖蛋白等組成，是從腫瘤中提取出來(lái)的，成分復(fù)雜。本試劑盒凝膠主要是由多肽和多糖構(gòu)成，為全人工合成的，無(wú)動(dòng)物源性。適用Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行3D培養(yǎng)，其后期染色非常困難，細(xì)胞也無(wú)法回收。使用本試劑盒進(jìn)行3D培養(yǎng)后的細(xì)胞可以輕松染色，并可以在保持細(xì)胞活性的情況下回收細(xì)胞。是您3D培養(yǎng)的理想選擇。
8 你們的3D培養(yǎng)凝膠和軟瓊脂一樣嗎？
答：我們的3D培養(yǎng)凝膠是人工合成的，其性能大大優(yōu)于軟瓊脂。
9.凝膠和細(xì)胞懸液混合這一步，是否有順序要求？
答：有。必須嚴(yán)格按照說(shuō)明書，先吸取凝膠到容器中，再往凝膠中加入細(xì)胞懸液，混勻。順序不可顛倒。否則不利于形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。
10.使用中如何吸取凝膠？
答：先將槍頭*剪掉，用 PBS 潤(rùn)洗，然后再吸取凝膠。慢慢松開移液槍的按鈕，按鈕彈回原位之后，讓槍頭在凝膠液面以下稍多停留一會(huì)兒，再提槍，轉(zhuǎn)移凝膠到其他容器中。
11.吸取凝膠與混勻凝膠過程中，產(chǎn)生的氣泡可否消除？
答：吸取與混勻凝膠過程中產(chǎn)生的氣泡不能消除，會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所以，應(yīng)盡量避免氣泡產(chǎn)生。
12.怎樣達(dá)到更好的鋪板效果？
答：鋪板前，采用分區(qū)域逐滴滴加的方式，把每一滴凝膠按一定排布次序滴在孔（或皿）的不同區(qū)域，滴好之后，用槍頭在凝膠表面輕輕引流，可獲得較為均勻的鋪板結(jié)果。鋪板后將培養(yǎng)板靜置孵育 5-30min，期間不要晃動(dòng)培養(yǎng)板。
13.何時(shí)*添加培養(yǎng)液？
答：37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育 5-30 min 形成穩(wěn)定凝膠結(jié)構(gòu)后即需要添加培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液貼壁緩慢加入孔板中。
14.*培養(yǎng)需要如何換液？
答：換液前注意先將負(fù)壓泵壓力調(diào)低。培養(yǎng) 48 小時(shí)之后再進(jìn)行*換液。換液時(shí)，棄掉2/3 左右的舊液即可，留少量舊液以避免吸走凝膠；生長(zhǎng)快的細(xì)胞，24 h 時(shí)可以換掉一半培養(yǎng)液。*換液時(shí)一定要緊貼培養(yǎng)孔壁，小心緩慢吸取舊液，避免吸掉剛貼附好的細(xì)胞。添加新液一定要貼壁、緩慢加入，以避免沖壞凝膠。此后可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度，視培養(yǎng)液的消耗情況來(lái)?yè)Q液。
