古朵生物：ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的注意事項(xiàng)

　　制作ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線是ELISA實(shí)驗(yàn)中的重要步驟，很多人都不知道如何制作，其實(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作很簡單，下面就跟隨古朵生物技術(shù)小編一起來看看ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線怎么制作吧!

　　在ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們得到的是經(jīng)酶標(biāo)儀得出的標(biāo)準(zhǔn)品以及樣本的OD值。其中，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度已知，我們可以利用標(biāo)準(zhǔn)品的OD值及其相對(duì)應(yīng)的濃度，以 OD值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用公式表示出來。這樣，我們把樣本的OD值以X值代入，便可求出Y值，即樣本濃度。

　　一、做標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品檢測(cè)時(shí)有幾個(gè)問題需要注意：

　　1、樣品的濃度等指標(biāo)是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來的，所以首先要把做標(biāo)準(zhǔn)曲線看作是比做正式實(shí)驗(yàn)還要重要的一件事，否則后面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無從談起。

　　2、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍要有一個(gè)比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品的濃度，即樣品的濃度要在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之內(nèi)，包括上限和下限。而對(duì)于呈S型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，盡量要使實(shí)驗(yàn)樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。

　　3、最好采用倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線中的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，這樣就能夠保證標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度不會(huì)出現(xiàn)較大的偏離。

　　4、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品時(shí)，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對(duì)低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。

　　5、標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品數(shù)一般為7個(gè)點(diǎn)，但至少要保證有5個(gè)點(diǎn)。

　　6、做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒?yàn)要求不同而有所變動(dòng)，但一般來說，相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98，對(duì)于有些實(shí)驗(yàn)，至少要0.99甚至是0.999.

　　二、選擇什么方程去擬合

　　用于免疫檢測(cè)的所謂“標(biāo)準(zhǔn)曲線"其實(shí)稱為擬合曲線比較合適。免疫檢測(cè)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)(可以是倍比稀釋的，也可以不是)濃度如果和相應(yīng)的吸光度(OD)值如果能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是理想的了，這時(shí)可以通過EXELL等獲得擬合曲線，進(jìn)而推算出樣品的濃度值。但做免疫檢測(cè)很少能夠有這么理想的情況，標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是“S”型的曲線關(guān)系，這時(shí)就不能用直線擬合的方式了，而對(duì)擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。

　　關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對(duì)數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只適用于曲線的一部分，有的適用于前半段，有的適用于后半段，有的適用于中間一段，而Logistic曲線則對(duì)曲線的全部都有較好的適用性。當(dāng)然，如果用于定量，還是在中間一段較好。這些方法雖然沒有一種方法可以通用，但也都可以用。關(guān)鍵在于你的標(biāo)準(zhǔn)曲線做到了S形的哪一部分，你想檢測(cè)的樣品濃度在曲線的哪一部分。在S曲線的低濃度部分可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部分可以用直線方程，中間部分可用對(duì)數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù)。

　　目前國際上流行的免疫檢測(cè)擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合”，用這種擬合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進(jìn)一步比較正確的獲得樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度值。

　　其實(shí)，在一個(gè)長的區(qū)間內(nèi)，Logistic應(yīng)該都能擬合得較為理想。但并不是說它就是萬能的。事實(shí)上不僅是ELISA，其它很多生物學(xué)反應(yīng)都是S形曲線，也都可以用Logistic曲線擬合。但建模型是一回事，而用它來定量是另一回事。如果用來定量，S形曲線的中間段(較陡處)是比較好的，而兩端的平坦部分計(jì)算誤差會(huì)大，有時(shí)甚至?xí)艽蟆?/p>

　　ELISA上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒