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大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備流程及轉(zhuǎn)化方法

2015年07月27日 09:14上?？婆d商貿(mào)有限公司點(diǎn)擊量：726

*天：

1. 將適合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37°C下過(guò)夜培養(yǎng)

2. 高溫滅菌大的離心瓶(250-500ml)以備第二天搖瓶用

3. 準(zhǔn)備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用

第二天：

4. 轉(zhuǎn)移0.2-1ml過(guò)夜培養(yǎng)物至裝有500ml LB(或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基)的1-2升搖瓶

5. 37°C下劇烈振蕩培養(yǎng)2-6小時(shí)

6. 定時(shí)監(jiān)控OD600值(培養(yǎng)1小時(shí)后每半小時(shí)測(cè)定一次)

7. 當(dāng)OD600值達(dá)到0.5-1.0時(shí)，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻至少15分鐘(需要的話這種方式可以存放培養(yǎng)液數(shù)小時(shí))

8. 細(xì)胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一兩天)

9. 用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。

10. 照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液

11. 照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞

12. 離心，棄上清液

13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞

14. 照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會(huì)很松散)

15. 用10%甘油重懸浮細(xì)胞至zui終體積為2-3ml

16. 將細(xì)胞按150μl等份裝入微量離心管，于-80°C保存

轉(zhuǎn)化方法：

1. 在冰上解凍電感受態(tài)細(xì)胞添加1-10μl DNA，冰上培育約5分鐘

2. 添加1-3μl DNA，冰上培育約5分鐘

3. 轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器(無(wú)泡)中

4. 加載P1000，準(zhǔn)備好300μl LB 或 2xYT

5. 對(duì)電穿孔容器進(jìn)行脈沖(200 歐姆， 25μFd，2.5 千伏)(檢查時(shí)間常數(shù)，應(yīng)該在3以上)

6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至電穿孔容器中

7. 37°C下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘至1小時(shí)以復(fù)原

8. 轉(zhuǎn)移細(xì)胞至適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)


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