近年來，人類組織干細胞的研究已成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點，表皮干細胞即是其中之一。表皮干細胞是一種在成年期還能維持較高的自我更新能力的細胞群，在正常狀態(tài)下維持表皮的自我更新，當(dāng)受到損傷刺激時，表皮干細胞可以參與皮膚損傷的修復(fù)[1]。隨著人口老齡化速度加快，慢性潰瘍及皮膚病患者日益增多，加之燒傷及意外創(chuàng)傷造成的皮膚缺損，臨床對皮膚移植的需求越來越大。由于表皮干細胞數(shù)量少,缺乏明確的特異性分子標(biāo)志,體外培養(yǎng)很容易丟失其干細胞生物學(xué)特性，增加了分離培養(yǎng)的難度。獲得大量高純度的表皮干細胞成為該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵技術(shù)。我們根據(jù)幾年來在細胞培養(yǎng)方面的工作實踐，將人表皮干細胞的培養(yǎng)技術(shù)總結(jié)如下。
1 人表皮干細胞的分離與培養(yǎng)
應(yīng)用IV型膠原快速粘附法從手術(shù)切除的人包皮組織中分離表皮細胞中的快速粘附細胞，這一群細胞被認為是表皮干細胞，它具有快速粘附、緩慢生長的特點[2]。取年齡在5～25歲無泌尿系統(tǒng)感染患者的包皮皮片，無菌條件下去除皮下脂肪層，用含*、*的PBS反復(fù)沖洗皮片數(shù)次，修剪成大小約0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培養(yǎng)皿中，加入0.25%*10 ml，4℃消化l4～16 h，吸棄上清，分離表皮和層。剪碎表皮，用0.25%*+0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM終止消化，反復(fù)吹吸至細胞懸浮，200目篩網(wǎng)研磨過濾。濾液經(jīng)1 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，棄上清，收集細胞。加入表皮干細胞培養(yǎng)基（每100 ml KSFM培養(yǎng)基加入0.05 mmol氯化鈣100 μl、HKGS添加劑1 ml）并輕柔吹打制成單細胞懸液，接種于預(yù)先鋪有Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶中，37℃孵育15 min。倒置鏡下觀察，粘附在Ⅳ型膠原被膜上的細胞為表皮干細胞，吸出細胞懸液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干細胞培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d換液1次，顯微鏡下觀察細胞生長，2～3 d內(nèi)細胞開始分裂，4～5 d后會出現(xiàn)許多細胞克隆或集落。培養(yǎng)基中鈣離子的濃度是保持人表皮干細胞既增殖又不分化的關(guān)鍵。鈣離子濃度過低，會導(dǎo)致所培養(yǎng)的人表皮干細胞生長緩慢或不生長;若鈣離子濃度過高，則加速了細胞分化。我們在實驗中篩選出適合的培養(yǎng)基中鈣離子濃度，可以保證有效的培養(yǎng)維持。在培養(yǎng)過程中，還要經(jīng)常檢查培養(yǎng)箱溫度和CO2的濃度，過低或過高的溫度和CO2含量都影響人表皮干細胞的生長，容易出現(xiàn)細胞老化和衰退現(xiàn)象。為了避免各種細菌、真菌污染培養(yǎng)箱，每周用75%的酒精擦洗箱內(nèi)的托盤、格架、箱壁。托盤始終裝有一定量的飽和濃度*（Na2HPO4）液體，細菌既不能在其中生長，也能提供合適的濕度[3]。
2 人表皮干細胞的傳代
當(dāng)原代細胞達到70%～80%融合時，需進行傳代，否則細胞會沒有足夠的生長空間，也會因為營養(yǎng)耗竭而影響生長[4]。用0.25%*+0.02%EDTA消化培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞，置37℃溫育5 min，必須經(jīng)常在顯微鏡下觀察細胞被消化的情況，若細胞部分漂浮起來，即可終止消化。加入2 ml終止液，用吸管反復(fù)輕輕吹打貼壁細胞，使其形成細胞懸液，按1∶2傳代。傳代細胞接種于IV型膠原預(yù)鋪的培養(yǎng)瓶中。
盡管目前的藥物和*有效干預(yù)了急性心肌梗死的發(fā)生和預(yù)后，但它的轉(zhuǎn)歸一直使我們束手無策。壞死的心肌無法再生，依靠纖維母細胞增生修復(fù)，形成的纖維瘢痕替代原心肌組織，功能喪失，zui終不可避免地發(fā)展為心力衰竭?，F(xiàn)有的治療手段有限，心臟移植又受到長期免疫抑制、感染機會多、供體來源不足、死亡率高等諸多因素的限制，干細胞移植越來越受到關(guān)注。
干細胞根據(jù)來源分為胚胎干細胞（ESCs）和成體干細胞。當(dāng)受精卵分裂發(fā)育為囊胚時，內(nèi)層細胞團的細胞即為胚胎干細胞。成體干細胞是指那些具有組織或器官特異性的干細胞，組織類型非常廣泛，和心肌細胞有關(guān)有骨髓造血干細胞、外周血干細胞、臍血干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、骨骼肌衛(wèi)星細胞（SCs）等。目前，研究zui多的用于治療心肌梗死的干細胞有胚胎干細胞、骨骼肌衛(wèi)星細胞和骨髓干細胞（Bone marrow stem cell，BMSc）。
在基礎(chǔ)研究方面，可以說三者在技術(shù)方法、成果等各個方面均取得了重大突破。但由于前兩者的某些缺陷，如ESCs的細胞來源困難及免疫抑制問題、SCs很難獲得足夠的細胞數(shù)量及移植后是否會形成異位興奮點等在短期內(nèi)不易解決，因此BMSczui被看好，且臨床應(yīng)用前景頗為樂觀。現(xiàn)就骨髓干細胞移植的成果、進展著重闡述。
1 骨髓干細胞的分類及特點
混合骨髓的干細胞成分中除造血干細胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）外，還有骨髓基質(zhì)中能分化為多種間質(zhì)成分的干細胞―――間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）。MSCs主要來源骨髓，人們還從臍帶血和外周血中及其它組織中分離得到MSCs。此外，骨髓干細胞的某些亞群在適當(dāng)條件下可誘導(dǎo)分化為心肌細胞或內(nèi)皮細胞。目前用于移植的自體骨髓干細胞主要包括:MSCs、骨髓單個核細胞（MNCs）、HSCs、內(nèi)皮祖細胞、SP細胞、CD34+/-、Lin-c-kit pos 細胞等。
1.1 骨髓間充質(zhì)干細胞 MSCs是各種間質(zhì)細胞的前體細胞，具有很強的增殖能力和多向分化潛能。Liechty KW等將**MSCs移植入羊子宮后，發(fā)現(xiàn)MSCs原位特異性分化為骨骼、軟骨、肌腱、骨骼基質(zhì)、肌肉和心肌細胞 [1] 。MSCs盡管含量僅2～5個/10 6 單個核細胞，但可體外擴增十億倍而不喪失干細胞活性。
2000年Wang JS等 [2] 觀察到MSCs具有微環(huán)境依賴性分化，移植4周后開始表達肌球蛋白重鏈、收縮蛋白等成心肌細胞表型，形成縫隙連接，MSCs能夠向心肌樣細胞分化并可能替代宿主心肌細胞。Toma C等 [3] 也證實了人類MSC分化為心肌細胞的表型水平和與宿主心肌的水平相一致（如肌絲蛋白，β肌球蛋白重鏈、α肌動蛋白、肌動蛋白T、肌鈣蛋白T、受磷蛋白）。Wang JS等 [4] 在2001進一步證實經(jīng)冠脈循環(huán)移植的MSCs也能夠定居心臟并分化為心肌細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞三種細胞系。Shake J等 [5] 建立豬的心肌梗死模型后，將標(biāo)記有Di-Ⅰ的自體骨髓間充質(zhì)干細胞注射入梗死心肌，每周檢測血液動力學(xué)和心功能，2周后可檢測到心肌特異蛋白，4周后心收縮功能改善、室壁變薄減輕，免疫組化顯示移植細胞移入并分化為心肌細胞。
研究表明，MSC分泌多種炎癥細胞因子，如白介素-1和腫瘤壞死因子-α和生長因子，如堿性成纖維生長因子、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、angiopoietin-1 [6] ，在干細胞分化成心肌細胞及血管內(nèi)皮中發(fā)揮積極作用。
1.2 骨髓造血干細胞 HSC除了具有重建受體造血與免疫功能外，在體外及體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)可向非細胞系列分化。1999年證實造血干細胞可起到成心肌細胞和內(nèi)皮祖細胞的作用。
2001年有兩個研究小組報道了骨髓造血干/祖細胞在不同的條件下可分化為心肌細胞。他們將綠色熒光蛋白（GFP）陽性的轉(zhuǎn)基因雄性小鼠Lin（-）c-kit + 和CD34 - /low c-kit + Sca-1 + 的骨髓造血干/祖細胞注射到梗死心肌附近。Orlic D等 [7，8] 在存活的受體小鼠梗死部位發(fā)現(xiàn)了帶狀新生細胞群，細胞中含多種心肌細胞特異蛋白，如肌球蛋白、轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、連結(jié)蛋白43等。GFP + 和Y染色體陽性提示該新生細胞群是由移植的Lin（-）c-kit + 骨髓造血干/祖細胞分化生成。結(jié)果證實受損的心肌功能得到了部分恢復(fù)。Jackson KA [9] 等將CD34 - /low c-kit + Sca-1 + HSCs（所謂的SP細胞）移植給受致死性照射的小鼠，再行冠脈結(jié)扎60min后再通。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分化的心肌細胞首先出現(xiàn)在梗死區(qū)周圍，約占總數(shù)的0.02%，并有LacZ和α肌動蛋白的表達而無FIT-1基因表達（FIT-1是內(nèi)皮細胞的標(biāo)志，在SP干細胞中缺乏），證明了HSCs的心肌再生潛能。
