實現(xiàn)的哺乳動物細胞培養(yǎng)
哺乳動物細胞培養(yǎng)已經(jīng)成為科研領域的基礎，細胞培養(yǎng)的質(zhì)量直接決定著實驗的成敗。此外，由于動物模型有時并不可靠，制藥公司也越來越傾向于用細胞測試藥物的安全性。“例如，苯會使人患白血病，但對小鼠就沒有這樣的效果，”Sigma-Aldrich的市場部Don Finley說。“我們不能直接在人體內(nèi)測試早期的實驗性藥物，而單靠動物模型也并不理想。”
培養(yǎng)高質(zhì)量的哺乳動物細胞是個技術(shù)活，許多因素都能在不知不覺間影響細胞的狀態(tài)。本文收集了一些細胞培養(yǎng)的實用技巧和專家心得，希望能夠幫你實現(xiàn)的哺乳動物細胞培養(yǎng)。
培養(yǎng)基和添加物的選擇
培養(yǎng)基的選擇取決于細胞的類型和實驗的目的，可以說培養(yǎng)基沒有“”只有“zui適”。如果是維持貼壁培養(yǎng)的哺乳動物細胞，一般選擇普通的DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）。對于非貼壁細胞而言，專門的懸浮培養(yǎng)基更好用。
在選擇合適培養(yǎng)基的時候，我們需要先了解細胞系的來源。這樣的信息可以從細胞的供應商獲取，也可以在文獻上查到。此外，歐洲細胞株/微生物保藏中心（ECACC）也為各種細胞系推薦了zui適培養(yǎng)基。有些特殊的細胞系，需要用特殊培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，例如專門生產(chǎn)蛋白的雜交瘤細胞。“培養(yǎng)基的分工越來越細，人們甚至可以根據(jù)特定細胞或蛋白表達的需要來訂制培養(yǎng)基，”Finley說，其所在的Sigma-Aldrich是ECACC的經(jīng)銷商。
對于不那么特殊的細胞，人們往往采用普通培養(yǎng)基（如DMEM），并輔之以支持細胞生長的因子。例如，許多研究人員會在基礎DMEM中添加胎牛血清FBS。“血清能夠提供多種營養(yǎng)物質(zhì)和粘附因子，”Sigma-Aldrich的市場部George Sitterley說。不同細胞對血清的需求量并不相同，因此可以事先對細胞進行測試。“我們建議從10%FBS開始，然后根據(jù)細胞活力進行增減，”Rockland Immunochemicals的技術(shù)帶頭人Tabitha Eckert說，該公司以生產(chǎn)抗體為主。“我們傾向于選擇含高糖和L-*的培養(yǎng)基，不同DMEM中這些成分并不相同。”葡萄糖和*是細胞的能源，不同類型的細胞對這些物質(zhì)的喜好程度也存在差異。“*往往很重要，我們可以用含*和不含*的培養(yǎng)基進行調(diào)配，得到zui合適的濃度。”Sitterley說。
有時人們會在細胞培養(yǎng)體系中添加抗生素以避免細菌污染，不過專家認為此舉應當謹慎。“有些細胞培養(yǎng)專家認為沒有必要使用抗生素，”Sitterley說。“不過，對于我們一般人來說，在短期應用中添加一定量的抗生素是可行的。但不要長期使用抗生素，因為一旦細菌產(chǎn)生抗性反而更加麻煩。我們不得不使用更多抗生素，而這會影響細胞的生長甚至殺死細胞。”
培養(yǎng)容器的選擇
細胞培養(yǎng)容器一般包括培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶，我們可以根據(jù)研究方法和細胞量進行選擇。單純對細胞進行擴增可以采用細胞培養(yǎng)瓶。而多孔板可以讓我們在培養(yǎng)細胞的同時，對細胞進行光學分析。在用細胞進行藥物篩選時，一般需要使用高密度的微孔板。
為了優(yōu)化抗體產(chǎn)量，Rockland Immunochemicals公司的研究者們很重視細胞培養(yǎng)容器的體積。他們先在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)細胞，然后根據(jù)抗體產(chǎn)量選擇合適的容器進行擴大培養(yǎng)。“不要總認為容器的體積越大，產(chǎn)量就會越大，”Eckert說。“有時小瓶與大瓶的效果一樣好。我們采用的培養(yǎng)瓶一般是TC處理過的，且?guī)в型馍w，這樣可以促進細胞貼壁和CO2氣體交換。”的確，不同類型的培養(yǎng)瓶具有不同的特點。例如，滾瓶適合大量懸浮細胞生長，能夠促進氣體交換。“也可以用不透氣的滾瓶進行培養(yǎng)，這樣細胞自己在其中產(chǎn)生CO2，”Eckert說。“能夠培養(yǎng)超過三十天。”
Corning公司的應用Mark Rothenberg指出，細胞系的生長特性也不容忽視。在選擇培養(yǎng)容器時，應考慮到所需的細胞量、細胞的倍增時間（doubling time）和細胞的理想密度。“可以采用T25cm2到T225cm2的容器，制定成比例放大的細胞培養(yǎng)計劃，”Rothenberg說。此外，市面上也涌現(xiàn)出了一批新產(chǎn)品可供選擇，例如Corning®的多層培養(yǎng)瓶或HYPERFlasks®。Sigma-Aldrich也正準備發(fā)布細胞培養(yǎng)系列，包括TC處理過的培養(yǎng)瓶、移液管、錐形管和冷凍管等。
如果需要對大量細胞進行長期培養(yǎng)，大型的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)或生物反應器就很有幫助，它們可以幫你控制多種參數(shù)，例如自動控制培養(yǎng)基更換、補料速率和氧氣/ CO2水平。“如果需要長期生產(chǎn)大量抗體，我建議使用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，”Eckert說。“我們現(xiàn)在使用的是Wheaton的CELLine™生物反應器，它可以放入標準培養(yǎng)箱，和培養(yǎng)瓶一樣好用。這一系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，不需要特殊培養(yǎng)箱，長期使用比其他系統(tǒng)更能節(jié)省培養(yǎng)時間。”
操作建議
基本的無菌操作是哺乳動物細胞培養(yǎng)中zui重要的技術(shù)之一。此外，維持一個細胞系還需要掌握接種、傳代、收獲、低溫保存和復蘇等技術(shù)。Rothenberg特別強調(diào)了做好培養(yǎng)記錄的重要性，他指出培養(yǎng)記錄應該包括所有的有用信息，例如細胞系的名稱和來源，培養(yǎng)條件，培養(yǎng)基要求，細胞系的照片，細胞系的驗證信息和支原體分析等等。
Sigma-Aldrich和ECACC將細胞培養(yǎng)的基礎操作匯編成冊，“其中包括了細胞培養(yǎng)的許多基本注意事項，”Sitterley說。“對于長期從事細胞培養(yǎng)的人類說，這個手冊只是入門的基礎讀物。不過對于新手來說，該手冊提供了許多實用技巧。”
一次操作一種細胞
細胞系之間交叉污染會混淆細胞系的來源，“實驗室中保存的細胞系，至少有35%并不可信，”Finley說。“在開始新研究時，能夠從ECACC等儲藏機構(gòu)獲取細胞。這樣的細胞不僅來源確定，而且保證不受支原體污染。”
Sitterley說：“美國癌癥研究協(xié)會旗下的所有刊物，都要求來稿的研究人員對所用細胞系進行驗證。”他舉了個例子，盡管張氏肝細胞早已被證實是HeLa細胞，但仍有研究者在用這種細胞進行肝臟研究。
一次只操作一種細胞系，可以避免交叉污染。“HeLa細胞就像野草，”Finley說。“它們在干燥條件也能生存，只要加入培養(yǎng)基就會繼續(xù)生長，很容易污染。”此外，同時操作多種細胞系，也很容易引入人為錯誤，這是人類的天性。
冷凍保存
冷凍保存一些細胞以備不時之需，能為研究提供重要保障，避免人為錯誤造成嚴重后果。“就算規(guī)劃得再好，也很難*避免污染，”Sitterley說。“如果在細胞受到污染前進行過冷凍保存，就不會造成難以挽回的局面。”
對細胞進行長期研究，也需要通過冷凍保存，在實驗室建立種細胞庫。“將培養(yǎng)的細胞分成若干小份，凍存在細胞庫中，”Sitterley說。“研究時取出一份進行擴增即可。”一段時間之后，我們可以從細胞庫中取出新一批細胞進行研究，以保證所研究的細胞永遠處于同一階段。不過，這樣的細胞庫需要保存在液氮中，因為細胞在冰箱里也會隨著時間推移而老化。“保存在液氮溫度下的細胞，基本保持一致狀態(tài)，”Sitterley說。“如果保存在-80°C，細胞會發(fā)生緩慢變化。”
在細胞培養(yǎng)工作中，經(jīng)驗是非常重要的，因此多練手始終是成功的*。
