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蛋白磷酸酶4（抗原）

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蛋白磷酸酶4(抗原)多克隆抗體主要是將有效抗原注入人體或動(dòng)物，由人或動(dòng)物體內(nèi)的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體

詳細(xì)介紹

蛋白磷酸酶4（抗原）單抗的標(biāo)記目前動(dòng)物用單抗，在動(dòng)物疫病診斷和檢疫、妊娠檢測(cè)、性別鑒定等方面有廣泛的應(yīng)用，大多以診斷試劑（盒）的形式提供，其中核心試劑為標(biāo)記的單抗。下面將介紹zui常用的幾種標(biāo)記技術(shù)。
（1） 酶標(biāo)記A、 辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記單抗和多克隆抗體的常用方法是過(guò)碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過(guò)碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過(guò)碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定Schiff氏堿。蛋白磷酸酶4（抗原）這里介紹兩種程序。
程序一：a.  將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)。
b.  加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。
c.  加入0.75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等（15mg/ml），混勻。
d.  稱取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下**的5ml注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用（避光）3小時(shí)或4℃過(guò)夜。
e.  用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí)（或4℃過(guò)夜）。
f.  將交聯(lián)物過(guò)Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）層析純化，分管收集*峰。g.  酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定：克分子比值測(cè)定酶量（mg/ml）=OD403×0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之間。酶結(jié)合率=酶量×體積/抗體，標(biāo)記率一般為0.3-0.6，即1-2個(gè)HRP分子結(jié)合在一個(gè)抗體分子上，標(biāo)記率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4時(shí)，E/P約為1。標(biāo)記率=OD403/OD280酶活性和抗體活性的測(cè)定 可應(yīng)用ELISA法、免疫擴(kuò)散、DAB-H2O2顯色反應(yīng)測(cè)定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價(jià)、特異性。
h. HRP抗體結(jié)合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝-20℃存放，防止反復(fù)凍融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否則會(huì)影響酶活性。必要時(shí)凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護(hù)劑。
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Tyrobutyricum Broth Base
CHO培養(yǎng)基基礎(chǔ) 250
CHO Medium Base
SCHAEDLER 瓊脂 250
SCHAEDLER AGAR
WILKINS-CHALGREN瓊脂 250
WILKINS-CHALGREN AGAR
MCP瓊脂 250
MCP Agar
厭氧菌瓊脂 250
Anaerobic Agar
CDC厭氧菌瓊脂 250
CDC Anaerobic Agar
溶血性鏈球菌
葡萄糖肉浸液肉湯 250
Dextrose Meat Infusion Broth
匹克 匹克氏肉湯基礎(chǔ)A 100
Pick’s Broth BaseA
肉浸液肉湯培養(yǎng)基 250
程序二：1. 將5mg HRP 溶于0.3mol/L PH8.1 NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無(wú)水乙醇溶液0.1ml，室溫?cái)嚢枳饔?小時(shí)，以封閉HRP分子上的α和ε氨基。
再加1ml 0.06mol/L 過(guò)碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30分鐘，溶液呈黃綠色；隨后加1ml 0.06mol/L 乙二醇，輕攪1小時(shí)，中止氧化反應(yīng)。
移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/L PH9.5碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過(guò)夜，更換三次緩沖液，注意避光。
吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mg IgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫輕攪2-3小時(shí)，避光；加入5mg NaBH4 ，4℃放置3小時(shí)或過(guò)夜，或換用乙醇胺（2mol/L PH9.5）0.2ml，作用7小時(shí)。
再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析24小時(shí)，更換三次緩沖液。
6. 用3000r/min離心30分鐘，除去沉淀物。上清液再用半飽和硫酸銨鹽析三次，沉淀用少許PBS溶解，透析或?qū)游龀}，必要時(shí)進(jìn)一步層析純化。7.8. 步驟同程序一。B、 堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記堿性磷酸酶（AP）用于標(biāo)記抗體，常用戊二醛一步法，將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個(gè)醛基結(jié)合，制備成結(jié)合物。該法簡(jiǎn)便，但所得產(chǎn)物不均一，抗體活性損失大，酶標(biāo)記率低。其程序如下：1. 將5mg AP加入1ml抗體溶液（2mg/ml）中溶解，裝入透析袋，于4℃對(duì)0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時(shí)，換液三次。2. 加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時(shí)，4℃對(duì)PBS透析過(guò)夜，其間換液三次。3. 換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析，4℃過(guò)夜，換液三次。4. 取出標(biāo)記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標(biāo)記物原液。5. 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆谩、 PAP、APAAP的制備PAP（過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)）、APAAP（堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)技術(shù)）的制備對(duì)于日益廣泛使用單抗的免疫細(xì)胞化學(xué)有重要意義?，F(xiàn)在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊和兔PAP、APAAP試劑供應(yīng)，只要配以相應(yīng)的橋抗體，即可非常便利地應(yīng)用單抗。因?yàn)镻AP法和APAAP法不用任何化學(xué)交聯(lián)劑處理酶和抗體，它們的活性均不受化學(xué)因素的影響，提高了敏感性和特異性。PAP和APAAP試劑的制備方法常采用先將HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或單抗中而獲得免疫沉淀物，再加入酶鹽水，過(guò)量的酶有助于免疫沉淀物的解離反應(yīng)，調(diào)PH至2.3，隨后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半飽和硫酸銨，純化PAP或APAAP。根據(jù)需要還可將PAP和APAAP試劑先與相應(yīng)橋抗體結(jié)合后，再與特定單抗組成完整的診斷試劑，這樣，單抗即可一步法用于診斷或檢測(cè)試驗(yàn)等。


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