兔抗D型產氣莢膜梭菌抗體單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。
熒光素標記
A、 異硫氰酸熒光素（FITC）標記FITC標記抗體的原理是在堿性條件下，F(xiàn)ITC 的異硫氰基能與IgG的自由氨基結合，形成IgG與熒光素的結合物。FITC是zui常用的熒光素，其次選用TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）。FITC和TRITC是常用的雙標記組合。其標記步驟如下：
a. 以碳酸鹽緩沖液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸餾水1000ml）調整抗體濃度至10mg/ml。
兔抗D型產氣莢膜梭菌抗體b. 取5ml抗體溶液置于10ml小燒杯中。
c. 稱取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內，邊加邊輕攪；其后室溫避光作用2小時。
d. 將交聯(lián)物經Sephadex G25或G50柱層析除去游離的熒光素；分管收集*峰為標記的抗體。
e. FITC的結合物質量鑒定IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般說，F(xiàn)ITC對抗體的摩爾比為3：1時適合于組織切片染色，為5-6：1時適合于細胞懸液染色。以標記抗體染色各種抗原，測定其特異性染色滴度和非特異染色的程度。
f. 標記抗體的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。
B、 異硫氰酸羅丹明（TRITC）標記: 基本與FITC標記相同。
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human similar to RIKEN cDNA 2610307008 gene 人類似RIKEN cDNA 2610307008 基因
human similar to RIKEN cDNA 2010109K09 gene 人類似RIKEN cDNA 2010109K09 基因
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human hypothetical protein LOC677340 人假定蛋白LOC677340
human hypothetical protein LOC433328 人假定蛋白LOC433328
同位素標記
必須強調的是在使用同位素標記單抗或其他蛋白之前，應掌握同位素操作和防護知識。正常情況下應包括避免物理的接觸和對γ-射線照射的有效保護，操作和使用同位素標記抗體時，應利用防護裝置，并合理處置含放射性的廢料。
A、碘標記用碘標記抗體是一種有效的標記方法。125I衰變產生低能的γ和Χ射線，很容易被檢測出來，而其60天的半衰期保證足夠的有效使用期，且能很方便地處理放射廢料。zui常用的碘標記方法是氯胺T法，即將氧化劑氯胺T加入到抗體和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I轉化成I2，游離I2可與抗體分子中*和一些*發(fā)生鹵化反應，用還原劑和游離*終止反應，經凝膠過濾將標記的抗體與碘化*及還原劑分離開。其主要操作步驟如下：
a. 在進行標記之前，先選用截流分子量為20000-50000的凝膠，制備1ml凝膠柱，然后分別用10倍體積的1%BSA/PBS/0.02%疊氮鈉和PBS洗滌柱體，封住柱下口，備用。
B、b. 加入10ug純化單抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸鈉（PH7.5）的1.5ml指形管內。隨后，加入500uCi Na125I混勻。
C、c. 加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室溫放置60秒。再加入50ul氯胺T終止液（含2.4mg/ml偏重亞硫酸鈉，10mg/ml*，10%甘油和0.1%環(huán)乙烷酰二甲苯的PBS）。
D、d. 將上述碘標記物上樣在凝膠柱表面，小心放開柱體下口，用1.5ml指形管收集。當?shù)鈽擞浳锶窟M入柱體，加入0.3ml含0.03%疊氮鈉的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重復進行，同時用同位素檢測儀測定標記與未標記的單抗。標記抗體大約在第二至第四管出現(xiàn)。無害化處理柱子和非單抗標記部分。e. 將標記單抗保存于4℃可使用6周時間。
B、 生物合成法標記將雜交瘤細胞培養(yǎng)在含有放射性前體的培養(yǎng)基中，隨著抗體分子的合成、組裝，同位素會標記在抗體分子的初級氨基酸鏈上，本方法不會導致抗體活性的喪失。其主要步驟是：
a. 離心收集處于對數(shù)生*的雜交瘤細胞，約需2×106個細胞。以預熱37℃不含*的培養(yǎng)基洗滌上述細胞。
b. 用含2% PBS不含*的培養(yǎng)基懸浮雜交瘤細胞至106個/ml，加入35S*（每次加入100uCi可產生105-106cpm的抗體）。
c. 經C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，離心后，吸出培養(yǎng)上清，分別加入1/20體積的1mol/L Tris（PH8.0）及疊氮鈉至濃度0.02%。該標記抗體可按純化單抗方法進行。
