ELISA試劑盒方針片斷收回后當即與pGEM-T載體做銜接反響。反響系統(tǒng)：2X銜接buffer 5μl，收回產(chǎn)品 3μl，T載體 1μl，T4銜接酶 1μl，共10μl;混勻，4℃放置16小時以上
轉(zhuǎn)化:
1、從-70℃冰箱中取40μl感受態(tài)細胞懸液,冰上凍結(jié)。
2、 參加銜接產(chǎn)品1-2μl (含量不超越50ng,體積不超越10μl),輕輕彈勻,冰上放置25分鐘后。(38μl ddH2O+20μl KCM+50μl感受態(tài))。
3、42℃水浴中熱擊45秒,熱擊后敏捷置于冰上冷卻2分鐘。
4、向管中參加0.6ml LB液體培育基(不含Amp),混勻后37℃振動培育1小時,使細菌康復正常成長狀況,并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
5、在加有氨芐的瓊脂糖平板上預加40μl的X-gal和4μl的IPTG，推棒涂勻，放置10min讓其充沛吸收
6、將上述菌液搖勻后取100μl 涂布于含Amp的選擇平板上,正面向上放置半小時,待菌液*被培育基吸收后倒置培育皿,37℃培育16-24小時。
7. 培育12小時后，選擇圓潤的菌落轉(zhuǎn)入另一個預加有40μl X-gal和4μl IPTG并劃分不一樣區(qū)域的平板上，37℃培育8小時。
陽性克隆的判定:
做菌落PCR選擇陽性克隆:在反響管中參加8μl無菌水，選擇單個菌落入管中，加10μl礦物油封住液面，95℃反響5min。結(jié)束后在每管中參加除模板外的別的反響系統(tǒng)，用量與反響條件與擴增一樣。選擇電泳成果好的測序。
注意事項
一起做兩個對照: 對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水替代DNA溶液,其它操作與上面一樣。此組正常狀況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落呈現(xiàn)。 對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水替代DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常狀況下應發(fā)生很多菌落。
1.將感受態(tài)細胞參加要轉(zhuǎn)化的東東(通常原則是轉(zhuǎn)化物體積不超越感受態(tài)細胞體積的十分之一)。冰上置半小時。
2.熱休克：42度，時間30秒至120秒都可以。通常書上都是90秒。
3.復蘇：熱休克后參加4倍體積的無抗生素培育基SOC(假如嫌費事，LB也可)，37度搖一小時。轉(zhuǎn)速zui低于220轉(zhuǎn)/分鐘。
4.涂板：4000轉(zhuǎn)離心2-3分鐘，剩余上清不要，留約200UL將菌液混勻，推平板，直到菌液根本涂干。37度孵箱放12-16小時。
ELISA試劑盒
