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上海撫生實(shí)業(yè)有限公司
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閱讀:241發(fā)布時(shí)間:2014-5-28
蛋白質(zhì)內(nèi)在或相關(guān)酶活性的測定
研究酶活性的技術(shù)路線
免疫沉淀的蛋白或蛋白復(fù)合物常保持有酶活性,在第三次洗滌之后,與微球結(jié)合的免疫復(fù)合物在反應(yīng)緩沖液中進(jìn)一步洗滌,zui后一次洗滌液正常情況下不含有底物,也可忽略ATP或其他能量來源。也會(huì)除去大部分的去污劑,如EDTA等可能封閉或減慢酶活性的物質(zhì),免疫復(fù)合物和微球可再懸浮在反應(yīng)緩沖液中。
在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)要考慮以下幾點(diǎn)。*,要記住在這些處理過程中酶動(dòng)力學(xué)會(huì)有很大改變,酶仍然與微球結(jié)合,所以它們不能通過溶液擴(kuò)散,因此反應(yīng)會(huì)遵循基本的原理。第二,微球密度大會(huì)很快沉到管底,這就意味著要在反應(yīng)過程中搖動(dòng)相鄰的管子,更容易的是,可以在反應(yīng)過程中吹打管底,再懸浮微球。
有些方法可用來終止反應(yīng)。應(yīng)根據(jù)相鄰的步驟進(jìn)行正確的選擇,如果檢測放射活性物質(zhì)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物的情況,如在蛋白激酶反應(yīng)中,ATP的[32p]丁磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子中,可通過加入樣本緩沖液終止反應(yīng)。此外,加熱反應(yīng)可阻止酶活性。其他一些方法包括將EDTA加入到雙價(jià)離子中(EDTA.Ca2+)或冷凍樣本。
將酶和微球結(jié)合可應(yīng)用于小量免疫親和純化,離心去除上清后即可使酶與底物分離。
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