IL—9的檢測
IL-9是由T細(xì)胞產(chǎn)生，天然IL-9可從TH細(xì)胞克隆TUC2．15和TUC7．51細(xì)胞的培養(yǎng)上清中獲得，人PBMC經(jīng)PHA、TPA、A23187等物質(zhì)刺激后也能合成IL-9。
(一)依賴細(xì)胞系TSl測定法
TSl細(xì)胞是C57BL／6小鼠TH細(xì)胞系。來源于TUC2．15克隆。將TUC2．15細(xì)胞在TUC2．15細(xì)胞條件上清中連續(xù)培養(yǎng)，直至使之失去對(duì)抗原或飼養(yǎng)細(xì)胞的依賴性。TSl只特異地依賴于IL-9生長，需在含IL-9的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)。具體操作步驟是將TSl細(xì)胞洗滌后，加入預(yù)先加有待測樣品的96孔培養(yǎng)板，每孔3×103細(xì)胞／100L，常規(guī)培養(yǎng)3d后，通過測定氨基己糖酶(hexosaminidase)水平或測定3H-TdR摻人值來判定細(xì)胞的增殖。
(二)M—07e細(xì)胞測定法
IL-9可刺激人巨幼紅細(xì)胞性白血病細(xì)胞系M-07e細(xì)胞的增殖，據(jù)此用3H-TdR摻人法可測定IL-9活性，亦可用比色法測定。但I(xiàn)L-3、IL-4、GM-CSF等亦可刺激M-07e細(xì)胞增殖，故標(biāo)本中含有這些細(xì)胞因子時(shí)，需用相應(yīng)的中和抗體處理后再測定。M-07e細(xì)胞對(duì)鼠ID9的敏感性與人IL-9相同，且對(duì)鼠源IL-3、IL-4和GM-CSF不發(fā)生反應(yīng)，故用于鼠IL-9測定時(shí)更方便。
1．向96孔培養(yǎng)板中加入*RPMI-1640，100t~L／孔，A排1～3孔不加。
2．用含10％NBS的RPMI-10將IL-9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至162U／mL，加入A排1—3孔，
150uL／孔。自A排1～3孔各取50／~L加入B排1～3孔，混勻。再自B排1～3孔取50／uL加入C排1—3孔，依次稀釋直至C排1～3孔，H排l～3孔不加，留作陰性對(duì)照。
3．待測標(biāo)本加入A排4、12孔，每份標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同步驟(2)進(jìn)行系列稀釋。
4．自培養(yǎng)瓶中收集M-07e細(xì)胞，1 500r／min室溫離心，去上清，加5mL*RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取106個(gè)活細(xì)胞加入15mL離心管中，加滿RPMI—1640液，同前離心以進(jìn)一步洗去維持培養(yǎng)液中可能殘留的IL-3和GM-CSF。
5．調(diào)整細(xì)胞濃度至105／mL，加入培養(yǎng)板中，100／tL／孔，置5％C02，37％溫箱中培養(yǎng)3d后，加3H-TdR繼續(xù)培養(yǎng)6～8h，收獲細(xì)胞測定cpm值。
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