免疫沉淀的實(shí)驗(yàn)過程
免疫沉淀的*步是制備抗原溶液。任何抗原溶液均可作為免疫沉淀的材料來源，但免疫沉淀一般采用細(xì)胞或組織制備的裂解物。裂解物的制備可采用多種方法，其中用溫和的去污劑如非離子去污劑來裂解細(xì)胞。該方法能溶解細(xì)胞膜，破壞蛋白質(zhì)之間許多微弱的相互作用，釋放出大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)抗原。更重要的是方法十分溫和，不破壞大多數(shù)抗原的結(jié)構(gòu)和酶的活力。如果對抗原結(jié)構(gòu)的完整或活力要求不嚴(yán)，或者抗原結(jié)合較為緊密，可以采用比較劇烈的條件來制備裂解物，如在強(qiáng)變性劑的溶液中進(jìn)行煮沸，然后在免疫沉淀前經(jīng)過稀釋去除變性劑。一旦細(xì)胞裂解液制備好，即可進(jìn)行預(yù)處理。
免疫沉淀一般用于分析抗原的生化特性，因此要求抗原的純度盡可能高?？乖涂贵w的相互作用與其各自的內(nèi)在性質(zhì)有關(guān)，故提高該技術(shù)信—噪比zui容易的方法是降低本底。如用不與待檢抗原結(jié)合的非特異性抗體預(yù)處理，可以從抗原溶液中除去非特異性結(jié)合蛋白，即此法*次是用非免疫抗體降低本底，第二次再用所研究的抗體，這樣進(jìn)行二次免疫沉淀是達(dá)到純化免疫沉淀物zui有效的方法。
經(jīng)過預(yù)處理后，在裂解物中加入特異性抗體， 由于抗體對其相應(yīng)抗原的高度親和力，因此容易快速形成免疫復(fù)合物。然后，將免疫復(fù)合物經(jīng)蛋白A或蛋白G結(jié)合的瓊脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基質(zhì)進(jìn)行純化。蛋白A和蛋白G對抗體的Fc段有較高的親和力。蛋白A／G與抗體結(jié)合后，通過洗滌微珠即可除去未結(jié)合的蛋白，剩下與基質(zhì)結(jié)合的即是純化的抗原抗體復(fù)合物。
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