用ELISA法檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌抗體
【摘要】：1983年Warren和Marshall從人胃粘膜成功地分離出幽門(mén)螺桿菌（Hp）之后，Hp與胃炎、消化性潰瘍的相關(guān)性引起人們極大的興趣。人們推測(cè)其可能成為這類(lèi)疾病的致病因素之一。許多研究者正進(jìn)一步探索其致病機(jī)理，并從不同角度尋找快速、可靠的檢測(cè)方法。迄今為止，檢測(cè)Hp的方法包括組織標(biāo)本培養(yǎng)，切片染色，細(xì)菌直接涂片染色，快速尿素酶測(cè)定及13C尿素呼吸試驗(yàn)和14C尿素呼吸試驗(yàn)等
相關(guān)專(zhuān)題
ELISA免疫實(shí)驗(yàn)技術(shù)
1983年Warren和Marshall從人胃粘膜成功地分離出幽門(mén)螺桿菌(Hp)之后，Hp與胃炎、消化性潰瘍的相關(guān)性引起人們極大的興趣。人們推測(cè)其可能成為這類(lèi)疾病的致病因素之一。許多研究者正進(jìn)一步探索其致病機(jī)理，并從不同角度尋找快速、可靠的檢測(cè)方法。迄今為止，檢測(cè)Hp的方法包括組織標(biāo)本培養(yǎng)，切片染色，細(xì)菌直接涂片染色，快速尿素酶測(cè)定及13C尿素呼吸試驗(yàn)和14C尿素呼吸試驗(yàn)等。除尿素呼吸試驗(yàn)外其余方法均需通過(guò)*檢查才能完成，鑒于取材困難，進(jìn)一步尋找檢測(cè)Hp感染的免疫學(xué)方不進(jìn)非常必要的。國(guó)外有人用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)檢測(cè)臨床病人血清中有Hp抗體報(bào)道，國(guó)內(nèi)尚未有這方面研究報(bào)告。本文報(bào)道建立一種檢測(cè)人體抗Hp抗體的ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及與細(xì)菌培養(yǎng)法和尿素酶測(cè)定法對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，研究證明本法特異、敏感、適用于大量標(biāo)本普查和及時(shí)判斷治療反應(yīng)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料和方法
1.1 材料
①40孔聚苯乙烯微量凹孔板：上海塑料三廠產(chǎn)品。②酶聯(lián)板離心籃：根據(jù)40孔酶聯(lián)板本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)制成。③DG—Ⅰ型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：南京華東電子管廠產(chǎn)品。④試劑：過(guò)氧化物酶(HRP)，R2=3.2，美國(guó)sigma公司產(chǎn)品。鄰苯二胺(OPD)：上海白鶴化工廠產(chǎn)品，按文獻(xiàn)配制。包被液：取碳酸鈉1.59g加*2.93g，蒸餾水1000ml配成。洗滌液：以上未加吐溫—20的洗滌液100ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液：5%小牛血清。戊二醛固定液：25%戊二醛液，100ml裝，Kochligh進(jìn)口分裝，用時(shí)稀釋成0.25%戊二醛固定液。終止液：2NH2SO4。⑤抗原的制備：將澳大利亞*佩思醫(yī)院的Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株(NCTC11638)及從*檢查患者胃粘膜活檢標(biāo)本分離出的Hp菌株分別接種于心腦血平板，37℃培養(yǎng)5d后取菌落作生化與血清學(xué)鑒定(自制兔抗Hp抗體)，然后取單個(gè)菌落移種于另一血平板，繼續(xù)培養(yǎng)3d，經(jīng)鑒定后將其大量增殖培養(yǎng)，3d后將菌苔刮下，置生理鹽水中制成菌液，加福爾馬林固定(0.1%～0.3%)，4℃過(guò)夜，3000r/nin離心30min，沉淀3次，將zui后1次沉淀懸于少量PBS液內(nèi)，用比濁管沒(méi)出細(xì)菌濃度，制成含菌3×109ml，置冰箱冰凍，反復(fù)凍融3次，經(jīng)顯微鏡檢查無(wú)菌體存在后，制成可溶性抗原，采用Lowry氏法蛋白定量，-20℃保存?zhèn)溆?。⑥臨床血清標(biāo)本：采自*檢查患者，隨機(jī)采取1988年8～10月*檢查病人共38人，抽靜脈血2ml，分離血清貯存-20℃?zhèn)溆?。⑦陰性?duì)照血清，進(jìn)行ELISA測(cè)定，取其平均OD值作對(duì)照。⑧酶標(biāo)羊抗人IgG結(jié)合物(SAHIgG—HRP)的制備：按過(guò)碘酸鹽改良法，略加改進(jìn)標(biāo)記制成酶標(biāo)抗體。即HRP8.0ml，22℃較攪20min。加乙二醇6滴，繼續(xù)攪拌5min，對(duì)pH4.2，0.001mol/L醋酸鹽緩沖液(用2molHC1調(diào)pH)透析過(guò)夜，中間換水4次，加羊抗人IgG(上海生物制品研究所產(chǎn)品)14mg，逐滴加pH，1.0mol碳酸鹽緩沖液，使pH升到9.0～9.5，室溫較攪2h，加硼氫化鈉(4mg/ml)0.2ml，置4℃2h，對(duì)pH7.2，0.01molPB-0.4molNaCl緩沖液在4℃透析平衡。換水4次，收取透析袋內(nèi)結(jié)合物，以50%飽和度硫酸銨溶液鹽析去除游離酶后，測(cè)定精制結(jié)合物，E/P克分子比值合格后，將結(jié)合物小瓶分裝置-20℃保存，備用。⑨尿素酶測(cè)定法和Hp的分離培養(yǎng)法參考文獻(xiàn)進(jìn)行。
1.2 方法
并稍加改進(jìn)，即：抗原包被微量滴定板：用包被液將抗原按2×108億/ml(含蛋白8.6μg)稀釋后，每孔加100μ，離心籃離心20min2000r/min后，倒去孔內(nèi)液體，然后加入0.25%戊二醛液50μl/孔，4℃固定30min，倒去戊二醛，用洗滌液洗3次(每次3min)，加5%小牛血清液，200ml/孔，經(jīng)37℃30min封板后倒去孔內(nèi)液體。每孔加待檢血清(1：100稀釋)100ml，37℃保溫1h后，如上洗滌3次，同時(shí)做陰性對(duì)照孔和空白孔。之后于各孔內(nèi)加和新鮮稀釋的酶標(biāo)羊抗人IgG結(jié)合物100ml，37℃保溫半小時(shí)，于各孔中加入2NH2SO450μl終止反應(yīng)后，于酶聯(lián)測(cè)定儀以波長(zhǎng)490nm測(cè)定OD值，將測(cè)得標(biāo)本OD值(P)與陰性對(duì)照OD值(N)比(P/N)，若P/N比大于或等于2.0為陽(yáng)性。
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