骨組織工程是利用組織工程學(xué)和生命科學(xué)原理，通過(guò)體外培養(yǎng)、擴(kuò)增種子細(xì)胞并誘導(dǎo)成為軟骨細(xì)胞或軟骨前體細(xì)胞后，復(fù)合載體或本身就在載體上繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，然后植入體內(nèi)軟骨或骨軟骨缺損處的一系列技術(shù)。目前該領(lǐng)域的研究主要集中在支架材料的構(gòu)建、種子細(xì)胞的篩選和標(biāo)準(zhǔn)化以及細(xì)胞與支架材料間相互作用機(jī)制。
構(gòu)建組織工程骨過(guò)程中，天然種子細(xì)胞存在各種不足：軟骨細(xì)胞增殖和傳代能力差，第5 代軟骨細(xì)胞已不具有特異性軟骨細(xì)胞外基質(zhì)特征，不能大量擴(kuò)增構(gòu)建組織工程軟骨組織；利用來(lái)源于胚胎組織的干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)雖取得了一定成功，但存在倫理方面限制；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其具有增殖傳代能力強(qiáng)、細(xì)胞均一性好以及多向分化潛能等特點(diǎn)，作為創(chuàng)傷缺損和退變修復(fù)的組織工程種子細(xì)胞逐漸受到重視，在體內(nèi)不同部位微環(huán)境或體外不同誘導(dǎo)因子的作用下，可分化成軟骨、骨骼、神經(jīng)、肌腱和肌肉組織等。
組織工程骨對(duì)骨缺損的修復(fù)過(guò)程包括：種子細(xì)胞與支架材料黏附→細(xì)胞在局部微環(huán)境向特定表型分化→細(xì)胞分泌胞外基質(zhì)參與生物材料降解、新骨生成及破骨活動(dòng)等。因此，種子細(xì)胞必須與材料發(fā)生適當(dāng)?shù)酿じ?，才能進(jìn)行遷移、增殖和分化。細(xì)胞通過(guò)黏附分子與材料附著、交換信號(hào)，產(chǎn)生細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)而遷移定位，并決定細(xì)胞的組織特異表型。由上述過(guò)程可以看出黏附和定向分化是種子細(xì)胞發(fā)揮功能的始動(dòng)階段和效應(yīng)階段的兩個(gè)重要過(guò)程，由此展開(kāi)對(duì)種子細(xì)胞的基因修飾，可望解決構(gòu)筑組織工程骨的關(guān)鍵步驟。
鈣黏蛋白11對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，可促進(jìn)細(xì)胞的黏附性能。利用核心結(jié)合因子α1對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，有望實(shí)現(xiàn)多能干細(xì)胞的成骨定向分化，并在誘導(dǎo)成骨分化的級(jí)聯(lián)效應(yīng)中發(fā)揮重要的信號(hào)作用。基于以上考慮，實(shí)驗(yàn)擬采用腺病毒作為載體，介導(dǎo)鈣黏蛋白11基因和核心結(jié)合因子α1基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀(guān)察兩基因的表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)方法：
重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMVCadherin- 11和pAdTrack-CMV-Cbfa1的構(gòu)建：利用 KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鈣黏蛋白11的全長(zhǎng) cDNA質(zhì)粒和全長(zhǎng)核心結(jié)合因子α1基因質(zhì)粒，并且各自回收目的片段，pAdTrack-CMV質(zhì)粒經(jīng)同樣的酶切處理使之線(xiàn)性化后，分別與目的基因片段連接，使片段定向克隆至含有相同黏性末端的穿梭質(zhì)粒上，經(jīng)轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆后，提取重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。
病毒的同源重組：按照pAdeasy腺病毒系統(tǒng)操作說(shuō)明， 將構(gòu)建正確的pAdTrack-CMVCadherin- 11 和pAdTrack-CMV-Cbfa1 穿梭質(zhì)粒用PmeⅠ酶切使之線(xiàn)性化，轉(zhuǎn)化已經(jīng)含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1 的大腸桿菌 AdEasier-1感受態(tài)細(xì)菌，在BJ5183細(xì)菌內(nèi)，超螺旋的pAdEasy-1 與線(xiàn)性化的pAdTrack- CMV-Cadherin-11和pAdTrack- CMV-Cbfa1發(fā)生重組，將外源基因整合入腺病毒載體的E1 區(qū)。
重組腺病毒質(zhì)粒pAd-Cadherin-11 和 pAd-Cbfa1的鑒定：按照pAdeasy腺病毒系統(tǒng)操作說(shuō)明，將同源重組獲得細(xì)菌克隆進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增和提取，利用PCR方法進(jìn)行鑒定。pAd- Cadherin-11引物：上游：5’- AGC GCT CCAAGC GTG G-3’，下游：5’-CTC CAA TGT CTG GAT CT-3’，擴(kuò)增約750 bp；pAd-Cbfa1引物：上游：5’-TAA GAA GAG CCA GGC AG-3’，下游：5’-AAC AGA TTC ATC CAT TC-3’，擴(kuò)增約500 bp；PCR反應(yīng)結(jié)束后凝膠電泳觀(guān)察結(jié)果。
在293細(xì)胞內(nèi)包裝重組腺病毒：取液氮凍存的293細(xì)胞復(fù)蘇，接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的Eagle’s MEM常規(guī)培養(yǎng)基中，另加100 U/mL*、100 U/mL *，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中恒溫恒濕培養(yǎng)。每一兩天更換培養(yǎng)基。應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將PacⅠ酶切線(xiàn)性化的重組腺病毒質(zhì)粒 pAd-Cadherin-11和pAd-Cbfa1共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 24~48 h用熒光顯微鏡觀(guān)察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，腺病毒的產(chǎn)生可以通過(guò)其表達(dá)的綠色熒光蛋白進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
重組腺病毒的擴(kuò)增及滴度測(cè)定：收集包裝后的病毒上清液，取1/2病毒上清重新感染293細(xì)胞，四五天后收集細(xì)胞，重復(fù)凍融方法收集病毒上清，繼續(xù)感染細(xì)胞，如此反復(fù)4次進(jìn)行病毒的大量擴(kuò)增，以進(jìn)一步提高滴度。按AdEasy™ XL Adenoviral Vector System 操作說(shuō)明進(jìn)行病毒的純化。滴度測(cè)定通過(guò)蝕斑分析來(lái)確定。
人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：從胸椎骨折患者的健康椎體抽取骨髓10 mL，肝素抗凝后Percoll法密度梯度離心，取中間單核細(xì)胞層以低糖DMEM洗滌2次，接種入75 cm2培養(yǎng)瓶，以含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、 100 U/mL*G鈉、100 mg/L*、0.25 mg/L *的低糖DMEM培養(yǎng)。24 h后換液，棄未貼壁的細(xì)胞，剩余貼壁細(xì)胞主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[10]。以后每?jī)扇鞊Q液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合后用*消化傳代。
病毒介導(dǎo)鈣黏蛋白11、核心結(jié)合因子α1在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)：利用所獲取2種病毒液同時(shí)感染分離的，感染48 h后，收獲細(xì)胞，按1 mL/ 10 cm2加入TRIZOL REAGENT抽提總蛋白，取定量2 μg 蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。將硝酸纖維素膜用含5%脫脂奶粉的TBS封閉過(guò)夜。將將小鼠抗鈣黏蛋白11、核心結(jié)合因子α1抗血清與含體積分?jǐn)?shù)為 5%牛血清白蛋白的TBS梯度稀釋后，與膜在室溫?fù)u床作用2 h，1×TBST洗膜5 min，×3次。按1∶2 000加入 HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，室溫?fù)u床作用45 min， 1×TBST洗膜5 min，×3次。將顯色液（H2O2/OPD）加到膜上，作用1 min后洗片。
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