ELISA試劑盒操作步驟復(fù)雜，影響反響要素較多，特別是固相載體的包被難到達(dá)各個別之間的共同，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不一樣濃度的參考規(guī)范品在相同的條件下制造規(guī)范曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA試劑盒，規(guī)范曲線的規(guī)模通常較寬，曲線zui高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，制作時常用半對數(shù)紙，以檢查物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)銜接，所得曲線通常呈S形，其頭、尾部曲線趨于平整，中心較呈直線的有些是的檢查區(qū)域。
測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其規(guī)范曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負(fù)相關(guān)。規(guī)范曲線的形狀因試劑盒所用形式的不同而略有不一樣。ELISA試劑盒測定的規(guī)范曲線示例見圖4-2。留意圖中橫坐標(biāo)為對數(shù)，這更有利于測定系統(tǒng)的表達(dá)。
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體的適宜溫度。在樹立ELISA辦法作反響動力學(xué)研討時，實(shí)驗(yàn)標(biāo)明，兩次抗原抗體反響通常在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)品的生成可達(dá)高峰。為加快反響，可進(jìn)步反響的溫度，有些實(shí)驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度?？乖贵w反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中一夜，以構(gòu)成zui多的沉淀。但因所需時刻太長，在ELISA中通常不予選用。
保溫的方法除有的ELISA試劑盒儀器附有特制的電熱塊外，通常均選用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA試劑盒板底應(yīng)貼著水面，使溫度敏捷平衡。為防止蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此刻可讓反響板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA試劑盒板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的資料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui終將ELISA試劑盒放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)則的溫度，特別是在氣溫較低的時分更應(yīng)如此。
無論是水浴還是濕盒溫育，反響板均不宜疊放，以確保各板的溫度都能敏捷平衡。室溫溫育的反響，操作時的室溫應(yīng)嚴(yán)厲約束在規(guī)則的規(guī)模內(nèi)，規(guī)范室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據(jù)說明書的請求控制溫育。室溫溫育時，ELISA試劑盒板只要平置于操作臺上即可。應(yīng)留意溫育的溫度和時刻應(yīng)按規(guī)則力求準(zhǔn)確。為確保這一點(diǎn)，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。
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