一、
zui近我們人ELISA試劑盒實驗室想做這個試驗，以前也沒有做過，如果有戰(zhàn)友做過這個試驗，希望介紹點經(jīng)驗和教訓(xùn)，謝謝了。應(yīng)戰(zhàn)友要求，在網(wǎng)上找了一下基礎(chǔ)資料，方便大家查看，雖然下面也列出了試驗方法，但在實際實驗室可能并不一樣，希望戰(zhàn)友們較少些自己的親身體會，讓大家和我本人在即將進行的試驗中少走彎路。先謝謝各位了。
免疫共沉淀
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；人ELISA試劑盒也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
其優(yōu)點為：
1. 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；
2. 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；
3. 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
缺點為：
1. 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；
2. 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；
3. 必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇zui后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。
實驗流程為：
1. 轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于4°C， zui大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；
2. 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1μg相應(yīng)的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；
3. 取10μl protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3,000 rpm離心3 min；
4. 將預(yù)處理過的10μl protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；
5. 免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C 以3,000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解緩沖液洗3－4次；zui后加入15μl的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；
6. SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析。
注意的問題：
1. 細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100）。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS），細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的cocktailer。
2. 使用明確的抗體，人ELISA試劑盒可以將幾種抗體共同使用
3. 使用對照抗體：
單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗
兔多克隆抗體：正常兔IgG
