一、神經(jīng)干細胞的定向誘導(dǎo)分化
將一部分次代神經(jīng)球機械分別制成單細胞懸液后分別參加條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中對照貼壁培養(yǎng)，7d后均行ChAT免疫細胞化學(xué)染色。
二、神經(jīng)干細胞的分別和傳代
無菌條件下取重生SD大鼠(出世48h內(nèi))腦組織，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準確分別海馬，用眼科剪將海馬剪碎后，再轉(zhuǎn)移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的無血清培養(yǎng)基，吸管吹打機械分別制造單細胞懸液，臺盼藍染色后細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×104~5個/ml，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔參加細胞懸液500μl。待神經(jīng)球構(gòu)成后再次機械分別克隆制造單細胞懸液，仍以5×104個/ml的細胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔參加細胞懸液500μl。爾后每7d機械分別克隆傳代1次，方法同前。
三、神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)分化
選取部分上述傳代后構(gòu)成的次代神經(jīng)球栽培于預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，并參加有血清培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神經(jīng)球于貼壁2h后行Nestin免疫細胞化學(xué)染色，另一部分神經(jīng)球持續(xù)培養(yǎng)，調(diào)查其生長分化情況。另將一部分次代神經(jīng)球機械分別制成單細胞懸液后參加有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，7d后分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細胞化學(xué)染色。
四、條件培養(yǎng)液的制備
取1g雞胚的后肢骨骼肌組織，參加9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心獲得上清液，過濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用。
五、BrdU符號
將BrdU溶于無血清培養(yǎng)基，過濾除菌后參加神經(jīng)球構(gòu)成后再次機械分別克隆制造的單細胞懸液中(BrdU終濃度為5μmol/L)，培養(yǎng)7d待新的神經(jīng)球構(gòu)成后，將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到預(yù)先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，貼壁2h行BrdU免疫細胞化學(xué)染色。
