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技術(shù)文章

雙抗體夾心法與間接法

閱讀：274發(fā)布時(shí)間：2019-5-31

雙抗體夾心法：

(1) 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反響孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗刷緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗刷，下同)。

(2) 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反響孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗刷。(一起做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。

(3) 加酶標(biāo)抗體：于各反響孔中，參加新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗刷。

(4) 加底物液顯色：于各反響孔中參加暫時(shí)制造的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

(5) 停止反響：于各反響孔中參加2M硫酸0.05ml。

(6) 成果斷定：可于白色背景上，直接用肉眼調(diào)查成果：反響孔內(nèi)色彩越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反響為無(wú)色或極淺，根據(jù)所呈色彩的深淺，以“+"、“-"號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

間接法：
   
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日洗刷3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反響孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗刷。(一起做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)于反響孔中，參加新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗刷,zui后一遍用DDW洗刷。其余過(guò)程同“雙抗體夾心法"的4、5、6。
 


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