每種免疫沉淀方法都有一套固定的操作程序，但都是以抗原-抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)。目前常規(guī)操作是利用共價結(jié)合蛋白A或蛋白G的瓊脂糖或磁性微球?qū)⒎磻?yīng)后的抗原-抗體復(fù)合物富集純化。
蛋白A和蛋白G能特異地和抗體的保守區(qū)Fc段結(jié)合，形成穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物附著在微球上，溶液內(nèi)無關(guān)的分子可以通過洗滌微球被清除，后，再采用一系列方法分析純化抗原或與抗原結(jié)合的其他分子。整個過程中值得注意的幾個關(guān)鍵影響因素如下：
1、樣品處理的質(zhì)量
免疫沉淀實驗成功的關(guān)鍵在于步樣品處理。免疫沉淀實驗本質(zhì)是處于天然構(gòu)象狀態(tài)的抗原和抗體之間的反應(yīng)，而樣品處理的質(zhì)量決定了抗原抗體反應(yīng)中抗原的質(zhì)量，如抗原的豐度及抗原的構(gòu)象狀態(tài)。
樣品處理應(yīng)根據(jù)抗原樣品的來源如組織樣品、細胞或其他形式的樣品，選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M行細胞或組織破碎，使待檢抗原釋放至樣品溶液中。裂解緩沖液的使用應(yīng)注意添加合適的蛋白酶抑制，避免抗原或抗原-其他分子復(fù)合物被降解，另外，應(yīng)選用去垢劑強度合適的裂解液，既保證有效裂解細胞釋放抗原又不破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用。
2、抗體的選擇
在考慮抗體特異性的同時，還需考慮抗體對抗原的親和力，如單克隆抗體只對抗原的單一表位具有良好的特異性，因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分，受到破壞，或受其他因素影響，造成抗體不能識別抗原，無法有效形成免疫沉淀復(fù)合物，那么這將直接影響免疫沉淀的結(jié)果。而多克隆抗體或混合單克隆抗體可以和抗原的多個表位結(jié)合，從而解決親和力的問題。但是，并不是所有抗體都能用于免疫沉淀，應(yīng)選用經(jīng)IP實驗驗證后的抗體以確保實驗結(jié)果的可靠性。此外，不同類型、同類不同亞型的抗體對蛋白 A或G的親和力不同，應(yīng)選擇合適的抗體及微球用于免疫沉淀。
3、微球的選擇
目前廣泛應(yīng)用于免疫沉淀的微球以結(jié)合了蛋白 A或G的瓊脂糖和磁性微球為主。瓊脂糖材料是無色透明、粒徑達微米級的具有多孔表面的微球，有巨大的表面積，蛋白結(jié)合量高，曾一度成為免疫沉淀技術(shù)中的主要材料。但在免疫沉淀操作中需要采用離心的方法達到固液分離，而反復(fù)離心產(chǎn)生的物理應(yīng)力極易破壞蛋白的天然構(gòu)象及完整性，且由于瓊脂糖本身容易破碎，不易保存，限制了瓊脂糖微球在免疫沉淀中的發(fā)展。
相比之下，磁性微球其核心為超順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子材料，表面平滑，粒徑可達納米級，比表面積大，單位重量的微球蛋白結(jié)合量更大。超順磁性微球可以在外加磁場中表現(xiàn)磁性，實現(xiàn)快速有效分離，大大縮短實驗操作時間。溫和的磁性分離方式避免反復(fù)離心對蛋白天然構(gòu)象及完整性的破壞。超順磁性微球在增大機械強度和穩(wěn)定性的同時，縮減了產(chǎn)品造價。上述的優(yōu)勢使超順磁性微球成為免疫沉淀試劑盒行業(yè)的新秀，逐漸被研究者所采用。
