此刻酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)品。反響的溫度和時刻仍是影響顯色的要素。在必定時刻內(nèi)，陰性孔可堅持無色，ELISA試劑盒而陽性孔則隨時刻的延伸而呈色加強。恰當進步溫度有助于加快顯色進行。在定量測定中，參加底物后的反響溫度和時刻應按規(guī)則力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時刻通常不需要嚴格控制，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的恰當縮短或延伸反響時刻，及時判別。
OPD底物顯色通常在室外溫或37℃反響20-30分鐘后即不再加深，再延伸反響時刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反響應避光進行，顯色反響結(jié)束時參加停止液停止反響。OPD產(chǎn)品用硫酸停止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反響調(diào)查成果。但為保證試驗成果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)則的恰當時刻閱覽成果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐步削弱，至2小時后即可*消退至無色。TMB的停止液有多種，ELISA試劑盒疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍色保持較長時刻（12-24小時）不褪，是目視判別的杰出停止劑。此外，各類酸性停止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此刻可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反響液；b.用洗刷液過洗一遍（將洗刷液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，行將洗刷液注滿板孔，放置1-2分鐘，間歇搖擺，浸泡時刻不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清洗毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗刷3-4次（或按闡明規(guī)則）。在間接法中如本底較高，可增加洗刷次數(shù)或延伸浸泡時刻。
微量滴定板多選用浸泡式洗刷法。洗刷液多為含非離子型洗刷劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的是疏水性的，非離子型洗刷劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵，然后削弱蛋白質(zhì)與固相載體的，并借助于親水基團和水分子的作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀況，然后脫離固相載體。洗刷液中的非離子型洗刷劑通常是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
（2）流水沖刷式 流水沖刷法zui初用于小珠載體的洗刷，洗刷液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗刷時附接一特別設備，使小珠在流水沖擊下不斷地翻滾淋洗，ELISA試劑盒繼續(xù)沖刷2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖刷式則比如淋浴，其洗刷作用更為*，且也簡潔、迅速。已有試驗標明，流水沖刷式相同也適用于微量滴定板的洗刷。洗刷時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗刷作用更佳。
