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                                    ELISA方法檢測抗原抗體分類

 ELISA技術(shù)可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個(gè)必要的試劑：
（1）固相化的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；

（3）酶反應(yīng)的底物。

    根據(jù)試劑的來源和樣本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。以下主要介紹幾種公司常用的檢測抗原的類型：

1、間接競爭法測抗原
　　樣本中的待測藥物和固相化的抗原共同競爭一定量的抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體（酶標(biāo)二抗）后能與固相化的抗原抗體復(fù)合物特異性結(jié)合，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥物含量愈高，競爭結(jié)合的抗體量愈多，從而結(jié)合在固相上的酶標(biāo)記抗抗體（酶標(biāo)二抗）量愈少，zui后的顯色也愈淺。本公司及國內(nèi)產(chǎn)品多用此法。具體操作步驟如下：

1）抗原固相化：將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

2）加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，再加入抗體，保溫反應(yīng)。樣本中藥物與固相抗原同時(shí)競爭與特異性抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結(jié)合不緊密的物質(zhì)。
3）加酶標(biāo)抗抗體，固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢藥物的量負(fù)相關(guān)。
4）加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測分析，測知樣本中抗原的量。

2、直接競爭法測抗原
　?。?）直接競爭酶標(biāo)抗原法測抗原

   樣本中的待測藥物和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥物含量愈高，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原量愈少，zui后的顯色也愈淺。

（2）直接競爭酶標(biāo)抗體法測抗原

樣本中的待測藥物和固相抗原競爭結(jié)合一定量的酶標(biāo)記抗體，經(jīng)底物顯色后檢測，樣本中藥物含量愈高，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，zui后顯色也愈淺。

    直接競爭法具體操作步驟如下：

1）抗原（或抗體）的固相化：將特異性抗原（或抗體）與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原（或抗體），洗滌除去未結(jié)合的抗原（或抗體）及雜質(zhì)。

2）加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，再加入酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原），保溫反應(yīng)。樣本中藥物與固相抗原（或酶標(biāo)抗原）同時(shí)競爭與特異性抗體（或固相抗體）結(jié)合，形成固相抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物（或抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物）。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結(jié)合不緊密的物質(zhì)。
3）加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測分析，測知樣本中抗原的量。

本公司目前正致力于研究酶標(biāo)記抗原和酶標(biāo)記抗體直接競爭法測定抗原，國外大部分ELISA試劑盒均采用此類型。

3、雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2） 加受檢樣本，保溫反應(yīng)，樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3） 加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)，固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合，*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。
4） 加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測分析，測知樣本中抗原的量。
　　在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢樣本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測。
　　在一步法測定中，當(dāng)樣本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復(fù)合物"。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標(biāo)準(zhǔn)曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)（hook effect），因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定樣本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。
　　假使在被測分子的不同位點(diǎn)上含有多個(gè)相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可
用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型
問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個(gè)亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)
性，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題。
　　雙抗體夾心法測抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng)。采用F（ab'）或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)。
　　雙抗體夾心法適用于測定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。