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ELISA抗原競爭法檢測樣品中sIL-2R含量

【基本原理】

本法是用純化或重組的IL-2R（α鏈，P55，CD25，Tac抗原）蛋白包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，同時(shí)加入已知量的抗IL-2RMcAb，再分別加入sIL-2R標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品。則待測sIL-2R或者sIL-2R標(biāo)準(zhǔn)品與包被的純化或重組的IL-2R蛋白競爭與抗IL-2R McAb結(jié)合。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照，從抗IL-2R McAb與包被的純化或重組的IL-2R蛋白結(jié)合受抑制程度來求得待測樣品中sIL-2R含量。

【材料和試劑】

（1）         純化或重組的IL-2R蛋白（α鏈，P55，CD25，Tac抗原）（40.000u/ml）

（2）         FITC標(biāo)記的抗IL-2R McAb（0.2μg/ml）：FITC為異硫氰酸熒光素，這里僅作為半抗原使用，而不作為熒光素標(biāo)記。

（3）         堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗FITC抗體（酶標(biāo)抗體）

（4）         對硝基苯磷酶鹽底物液；用pH9.8的二乙醇胺緩沖液溶解，配成濃度為1mg/ml。

（5）         1%牛血清白蛋白-PBS（1%BSA-PBS）：為封閉液點(diǎn)稀釋液

（6）         不同倍比稀釋度的sIL-2R標(biāo)準(zhǔn)品：以1% BSA-PBS稀釋。

（7）         洗滌液（0.05%Tween20-PBS）

（8）         待測sIL-2R樣品

（9）         96孔酶標(biāo)板（聚苯乙烯板），酶標(biāo)儀，波長465nm濾光片

（10）      刻度吸管，毛細(xì)吸管，加樣器（頭），4℃冰箱

【操作步驟】

（1）         以一定濃度的純化或重組的IL-2R（P55）蛋白包被96孔酶標(biāo)板，100ul/孔，4℃過夜（16-72h）；

（2）         棄包被液，用1%BSA-PBS封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，200ul/孔，置室溫2h；

（3）         用洗滌液加滿各孔置3min，然后傾去，反復(fù)洗滌3次；

（4）         分別加入不同稀釋度的sIL-2R標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品，50μl/孔；

（5）         各孔均加入FITC標(biāo)記的IL-2R McAb，50μl/孔，充分混勻后置室溫2h；

（6）         同上洗滌3次；

（7）         各孔均加入堿性磷酶酶標(biāo)記的兔抗FITC抗體，100μl/孔，置室溫1h；

（8）         同上洗滌3次；

（9）         各孔均加入底物液，100μl/孔，置室溫15-30min；

（10）      用酶標(biāo)儀以波長405nm測各孔OD值。

【結(jié)果分析】

（1）         以sIL-2R標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋度對應(yīng)的濃度值為橫座標(biāo)（X），相應(yīng)的OD值為縱座標(biāo)（Y），在普通座標(biāo)紙上繪制競爭抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，OD值隨標(biāo)準(zhǔn)品sIL-2R濃度升高而降低。

（2）         根據(jù)待測樣品所測得的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品sIL-2R含量。

（3）         本方法測定sIL-2R含量時(shí)，不需要計(jì)算抑制百分率。

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