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補(bǔ)益中藥對(duì)運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟炎癥因子及 ECM 表達(dá)的影響
鄭孟君1，曹建民2，郭 嫻2，周海濤3
(1． 江南大學(xué) 體育學(xué)院，江蘇 無錫 214000;2． 北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084;
3． 北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023)

摘 要: 觀察補(bǔ)益中藥對(duì)運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟炎癥因子及 ECM 表達(dá)的影響。方法:75 只 7 周齡雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為 4 組:安靜對(duì)照組(C 組，12 只)、一般訓(xùn)練組(M 組，12 只)、過度訓(xùn)練組(OM 組，24 只)和補(bǔ)益中藥 + 過度訓(xùn)練組(TM 組，24 只)，M、OM、TM 組進(jìn)行 8 周 56 天的游泳訓(xùn)練。采用專業(yè)灌胃器每天灌胃 1 次，TM 組灌胃采用黃芪、紅景天、丹參、苦參等組成的復(fù)合中藥制劑，劑量為 1 g·kg － 1，體積為 5 mL·kg － 1，其他各組灌胃等量生理鹽水。末次訓(xùn)練后 24 h，采用 PAS 染色觀察腎小球 ECM 沉積情況，免疫組織化學(xué)法檢測腎組織 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白表達(dá)，RT-PCR 法檢測腎組織 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、IL-18 mRNA、TGF-β1 mRNA
表達(dá)。結(jié)果:1)8 周實(shí)驗(yàn)后，腎小球 ECM 沉積，C、M 組間無顯著差異(P ＞ 0. 05);OM 組較 C、M 組顯著增加(P ＜0. 01);TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05)。2)血尿素氮和血清肌酐水平，OM 組和 TM 組顯著高于 C 組(P ＜ 0. 01)，TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05);腎組織 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-18 蛋白表達(dá)，OM 組和 TM 組顯著高于 C 組(P ＜0. 01)，TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05);腎組織 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA 和 IL-18 mRNA 表達(dá)，OM、TM 組顯著高于 C 組(P ＜ 0. 01)，TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05);腎組織 TGF-β1mRNA 表達(dá)，TM 組(P ＜ 0. 05)和OM 組(P ＜ 0. 01)顯著高于 C 組，TM 組顯著低于 OM 組(P ＜ 0. 05)。結(jié)論:8 周過度訓(xùn)練致大鼠發(fā)生運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注，同時(shí) ECM 沉積加強(qiáng)。補(bǔ)充補(bǔ)益中藥可通過抑制腎臟組織 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 的表達(dá)進(jìn)而減輕了過度訓(xùn)練誘導(dǎo)腎臟缺血再灌注發(fā)生時(shí)腎臟組織 TGF-β1 的表達(dá)，抑制 ECM 的合成和(或)促進(jìn) ECM 的降解及組織病理學(xué)變，延緩或避免過度訓(xùn)練導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性缺血再灌注對(duì)腎臟的損害。
關(guān)鍵詞: 補(bǔ)益中藥;運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷;炎癥因子;細(xì)胞外基質(zhì)

腎臟對(duì)缺血及缺血再灌注損傷異常敏感，運(yùn)動(dòng)及其恢復(fù)期腎血流量的兩個(gè)時(shí)相的改變導(dǎo)致了運(yùn)動(dòng)
性腎缺血再灌注損傷(exercise-related renal ischemiareperfusion injury，ERRIRI) 的整個(gè)過程［1］。近年的研究表明:在急性腎缺血再灌注損傷中 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18 這組功能密切相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮著重要作用［2］。腎缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的炎癥因子的表達(dá)可以引起腎臟固有細(xì)胞的增殖，刺激其表達(dá)粘附分子并生成過多的細(xì)胞外基質(zhì)( extracellularmatrix，ECM)，進(jìn)而影響腎臟細(xì)胞外基質(zhì)代謝平衡，并直接影響到組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化［3］。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨而通于腦。腎中精氣所化生之元?dú)猓哂型苿?dòng)人體生長發(fā)育，溫煦和激發(fā)人體各臟腑、經(jīng)絡(luò)等組織器官活動(dòng)的作用，為人體諸氣的根本［4］。長期過度訓(xùn)練導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性疲勞，先耗傷脾陽，久則及腎;脾腎同為精血生化之源，陽氣之根本，脾腎耗傷，陽氣受損，精血生化不足，則導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)的原動(dòng)力不足，產(chǎn)生諸多疲勞綜合癥［5］。具有多靶點(diǎn)、多途徑作用且?guī)缀醪缓`禁成分優(yōu)勢的中藥，對(duì)過度訓(xùn)練導(dǎo)致的 ERRIRI 的保護(hù)作用，已為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界所重視。但目前有關(guān)中藥對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與炎癥細(xì)胞因子及腎組織細(xì)胞外基質(zhì)代謝間的相互作用關(guān)系的調(diào)節(jié)功能的研究尚未見報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)選用黃芪、紅景天、丹參、苦參等中藥材，結(jié)合前期研究適當(dāng)增減組方制成復(fù)合中藥制劑，觀察其對(duì)炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白及基因表達(dá)的影響及對(duì)腎臟 ECM 代謝、ECM 沉積的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而研究補(bǔ)益中藥對(duì)過度訓(xùn)練導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。
1 材料與方法
1. 1 動(dòng)物和分組［6］
清潔級(jí) 75 只雄性 Wistar 大鼠，49 d 齡，體重(196. 95 ± 11. 36)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科
學(xué)部提供，動(dòng)物生產(chǎn)合格證編號(hào) SCXK(京)2006 －0008。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)室溫度保持在(22 ± 2)℃，
相對(duì)濕度 55% ～ 75% ，光照時(shí)間隨自然變化。大鼠以基礎(chǔ)飼料(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提
供) 和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。實(shí)驗(yàn)時(shí)間為63d，正式訓(xùn)練 56d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)
營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室完成。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 4 d 后，以 20 min·d － 1的運(yùn)動(dòng)量對(duì)其進(jìn)行為期 3d 的篩選，淘汰個(gè)別不適應(yīng)的游泳者，剔除不符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠，剩余大鼠以數(shù)字隨機(jī)分組法分為 4 組:對(duì)照組(C 組，12 只)、一般訓(xùn)練組(M 組，12 只)、過度訓(xùn)練組(OM 組，24 只)和中藥+ 過度訓(xùn)練組(TM 組，24 只)。采用專業(yè)灌胃器每天灌胃一次，TM 組劑量為 1 g·kg － 1，灌胃體積為 5mL·kg － 1，其他各組灌胃等量生理鹽水。
1. 2 實(shí)驗(yàn)用藥
復(fù)合補(bǔ)益中藥制劑主要成分為黃芪、紅景天、丹參、苦參等，購自北京同仁堂，批號(hào):120324154，并經(jīng)
天津中瑞藥業(yè)有限公司高級(jí)工程師高占友鑒定。按比例稱取藥品 50 g 加水 500 mL，浸泡 30 min 后煎
30 min，過濾所得水煎液，再將過濾后的水煎液加水500 mL 煎 30 min，過濾所得水煎液。將兩次過濾的水煎液混合，濃縮至濃度 1 g(生藥)·mL － 1，4 ℃ 存放備用［6］。
1. 3 訓(xùn)練及測試方案
C 組常規(guī)飼養(yǎng)，不運(yùn)動(dòng)，無任何干預(yù)。M 組進(jìn)行正式中等強(qiáng)度游泳訓(xùn)練 8 周(無負(fù)重)，每周 6 d，每
天 1 次，第 1 次下水游 20 min，此后逐漸增加，至第 1周末每天游 60 min，第 2 周末加至每天游 90 min，第3 周末加至每天游 120 min，此后 5 周均保持此運(yùn)動(dòng)量。TM 組和 OM 組前3 周訓(xùn)練時(shí)間安排同 M 組，第4 周起開始安排高強(qiáng)度訓(xùn)練。第 1 ～ 3 周負(fù) 0. 5% 體重，第 4 周負(fù) 1% 體重，第 5 周負(fù) 2% 體重，每天訓(xùn)練1 次。第 6 周負(fù) 2% 體重，每天上、下午各訓(xùn)練 1 次，第 7 ～ 8 周，每天上午、下午、夜間各訓(xùn)練 1 次，均負(fù)5% 體重［6］。大鼠進(jìn)行負(fù)重游泳，每次訓(xùn)練至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)以大鼠下沉后 10 s 不露出水面為準(zhǔn)。C、M 組大鼠均正常生長，無意外死亡。TM 組和 OM 組大鼠因尾部負(fù)重，疲勞、力竭不能恢復(fù)及訓(xùn)練意外死亡等原因，死亡率較高。至第 8 周末時(shí)，TM 組 24 只僅剩 14 只，OM 組 24 只僅剩 11 只。
1. 4 指標(biāo)測定
末次游泳訓(xùn)練 24 h 后，各組大鼠yi醚適度麻醉，頸總動(dòng)脈取血，加入檸檬酸鈉溶液抗凝，37 ℃ 水浴 30 min 后，4 ℃、3 000 r /min 離心 10 min，分離制備血清，置 － 20 ℃ 冰箱中保存待查。迅速取腎，剔除筋膜，置于預(yù)冷的生理鹽水中洗凈血污，觀察腎臟大小、色澤、質(zhì)地，切取腎組織，分別用消毒鋁箔包好，迅速投入液氮暫存，隨后保存于 － 70 ℃ 冰箱凍存待測［6］。取部分腎組織，10% 甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm 厚切片，PAS 染色并進(jìn)行組織病理學(xué)分析。采用 Jaffe ku味酸法測定血清肌酐，采用二乙酰 － 肟法測定血清尿素氮，采用免疫組織化學(xué)法測定檢測腎組織 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 蛋白表達(dá)，采用 RTPCR 法測定腎組織 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、TGF-β1 基因表達(dá)。以上試劑盒均由上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司提供。
1. 5 PAS 染色切片圖像分析
PAS 染色切片，在 400 × 物鏡下采用北航圖像采集模塊軟件采集視野中同時(shí)切到尿極和血管極的腎小球(每張切片約有 8 ～ 10 個(gè))，隨后運(yùn)用北航醫(yī)學(xué)病理圖像分析軟件描繪腎小球毛細(xì)血管拌輪廓，區(qū)分基質(zhì)和細(xì)胞成分，并測量單個(gè)腎小球平均面積及其基質(zhì)面積［18］。
1. 6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用 SPSS 12. 0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、處理，數(shù)據(jù)用平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(X珔± S)表示，組間差異
采用方差分析，等級(jí)計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)分析，相關(guān)關(guān)系采用 Pearson 相關(guān)分析。顯著性水平為 P ＜0. 05，非常顯著性水平為 P ＜ 0. 01。

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