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茶多酚對(duì)體外培養(yǎng)鼠晶狀體抗氧化損傷作用的研究

李 佳，劉 丹

摘要目的:觀察茶多酚( tea polyphenols，TP) 對(duì)氧化損傷鼠晶狀體的形態(tài)學(xué)及抗氧化系統(tǒng)的變化，研究其對(duì)晶狀體氧化損傷的保護(hù)作用。方法:采用體外培養(yǎng)鼠晶狀體的氧化損傷模型，設(shè)置正常對(duì)照組、氧化損傷( H2O2 ) 組和 TP( H2O2 + TP) 組，分別于12，24，48h 后觀察各組晶狀體的混濁情況，并檢測(cè)各組晶狀體的抗氧化酶系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶( SOD) 及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶( GSH-Px) 活性以及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)終產(chǎn)物丙二醛( MDA) 的含量。結(jié)果:正常對(duì)照組晶狀體均保持透明，未見白內(nèi)障形成;H2O2組大鼠離體晶狀體隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，晶狀體的混濁程度逐漸明顯增加; TP 組的晶狀體混濁較 H2O2組明顯減輕，白內(nèi)障形成不明顯。晶狀體混濁相對(duì)灰度值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05) 。H2O2組大鼠晶狀體組織中 MDA 含量較對(duì)照組明顯增高( P ＜ 0． 05) ，而 GSH-Px和 SOD 明顯下降( P ＜ 0． 05) ，TP 組與 H2 O2 組相比，其晶狀體中MDA 降低( P ＜ 0． 05) ，但仍高于對(duì)照組，而 GSH-Px和 ATP 含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0． 05) 。結(jié)論:TP 可提高氧化損傷晶狀體的抗氧化能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物水平，從而延緩白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展，為臨床白內(nèi)障的診療提供了新的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:茶多酚; 白內(nèi)障; 氧化損傷; 過(guò)氧化氫DOI

李佳，劉丹． 茶多酚對(duì)體外培養(yǎng)鼠晶狀體抗氧化損傷作用的研究． 眼科雜志 2012; 12( 2) : 215-2170 引言白內(nèi)障是世界上主要的致盲病因之一，同時(shí)在我國(guó)也是位列位的致盲眼病。近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究均指出眼組織內(nèi)活性氧和氧自由基的增加、抗氧化防御系統(tǒng)力量的削弱是白內(nèi)障主要成因之一，但對(duì)晶狀體氧化損傷的途徑尚未*清楚，對(duì)白內(nèi)障形成的機(jī)制尚有爭(zhēng)議［1，2］。因此研究白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，尋找能夠延緩白內(nèi)障發(fā)展的藥物是防治白內(nèi)障研究的熱點(diǎn)。目前已有很多治療白內(nèi)障的藥物在使用，但其療效欠佳［3］。本研究建立體外培養(yǎng)鼠晶狀體氧化損傷的模型，應(yīng)用抗氧化劑茶多酚( tea polyphenols，TP) 對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)晶狀體中抗氧化酶系統(tǒng)的活性，從而探討 TP 對(duì)氧化損傷所致白內(nèi)障的影響作用，為氧化損傷性白內(nèi)障的防治尋找新的理論依據(jù)和途徑。

1 材料和方法

1． 1 材料 健康 SD 大鼠 57 只，雌雄各半，體質(zhì)量 200 ～215Int Eye Sci，Vol． 12，No． 2，F(xiàn)eb． 2012.250g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。茶 多 酚( 純 度99． 9% ，上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司) ，300mL /L 過(guò)氧化氫溶液( 南昌市東湖青山試劑助劑廠) 分析純，復(fù)方托吡卡胺滴眼液( 參天制藥株式會(huì)社) ，超氧化物歧化酶( SOD)測(cè)試盒( 南京建成生物工程研究所) ，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶( GSH-Px) 測(cè)試盒( 南京建成生物工程研究所) ，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)終產(chǎn)物丙二醛( MDA) 測(cè)試盒( 南京建成生物工程研究所) ，眼科顯微手術(shù)器械( 蘇州器械六廠) ，超凈工作臺(tái)( 蘇州凈化設(shè)備廠) ，倒置顯微鏡( IX70 型，日本 Olympus公司) ，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱( Forma Scientific，3164) ，裂隙燈顯微鏡( 蘇州儀器六廠) ，掃描電鏡( HITACHI，S-570) ，可見分光光度計(jì)( 上海菁華科技儀器有限公司，752N) 。

1． 2 方法

1． 2． 1 標(biāo)本的處理 復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳后于裂隙燈顯微鏡下檢查晶狀體的透明性，全部實(shí)驗(yàn)大鼠晶狀體均透明。將大鼠頸椎脫臼處死后，鉗取完整眼球，9g /L 生理鹽水沖洗，再用 750mL /L 乙醇沖洗數(shù)秒后，用含 320kU/L慶大霉素的 PBS 溶液和含 800kU/L 青霉素、1 000kU/L 鏈霉素的 PBS 溶液各沖洗 10min。在手術(shù)顯微鏡下從后極部剪開鞏膜取出晶狀體( 保留部分覆蓋在晶狀體表面的玻璃體) ，放入含 5kU/L 青霉素、50kU/L 鏈霉素的 MEM培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，以供實(shí)驗(yàn)用。

1． 2． 2 實(shí)驗(yàn)分組 將篩選出的 114 個(gè)晶狀體隨機(jī)分 3 組，其中正常對(duì)照組 14 個(gè)，氧化損傷( H2O2 ) 組和 TP 組各 50個(gè)，每組 12，24，48h 隨機(jī)選取 4 個(gè)晶狀體，分組如下: ( 1)正常對(duì)照組: MEM 培養(yǎng)液 30mL，內(nèi)含 100mL /L 小牛血清、5kU/L 青霉素、50kU/L 鏈霉素; ( 2) H2 O2 組: 除對(duì)照組培養(yǎng)液外，另加 300mL /L H2 O2 1． 02μL( H2 O2 終 濃 度 為300μmol /L) ; ( 3) TP 組: 除 H2O2組各成分外，另加 TP 5mL( TP 濃 度 為 0． 2mg /L) 。于 37℃，50mL /L CO2，濕 度 為95% 的培養(yǎng)箱中孵育。除對(duì)照組外，其它各組均應(yīng)在第6，12，18h 分別加入 300mL /L H2O2 0． 8μL，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中 H2 O2 濃度達(dá)到 300μmol /L。分別在加入培養(yǎng)液后于12，24，48h 停止孵育，取標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

1． 2． 3 掃描電鏡觀察 每組培養(yǎng) 48h 后各取 2 個(gè)晶狀體，立即置入 25mL /L 戊二醛溶液中固定，0 ～ 4℃ 冰箱內(nèi)保存，72h 后取出，在赤道部切取 1mm2柱狀晶狀體結(jié)構(gòu)( 帶有囊膜) 作為透射電鏡的樣本，用 0． 1mol /L 磷酸鹽液沖洗，1% 鋨酸固定 2h，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂滲透包埋，鈾鉛重金屬染色，掃描電鏡觀察并照相。

1． 2． 4 晶狀體相對(duì)灰度值的觀察 分別將被檢晶狀體于12，24，48h 在光學(xué)顯微鏡下觀察，在 24 孔板下襯以白底黑色“井”狀背景拍照，并觀察晶狀體混濁程度，將照片掃描入電腦，并用 Micrografx Picture Publisher 軟件分析圖像中黑色“井”字的每個(gè)交叉點(diǎn)的灰度和鄰近交叉點(diǎn)的白色背景的灰度，兩者之差即為相對(duì)灰度值。

1． 2． 5 抗氧化酶活性的測(cè)定

1． 2． 5． 1 晶狀體谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的測(cè)定 分別于培養(yǎng) 12，24，48h 取出大鼠晶狀體，用 0 ～ 4℃ PBS 充分沖洗，再用濾紙吸干后稱質(zhì)量，置入含 5mL 0 ～ 4℃ PBS 的勻漿器內(nèi)，冰浴下充分研磨 5min 制成勻漿，低溫高速離心機(jī)10 000r/min 離心 15min，取上清液，羥胺法測(cè)定 GSH-Px 含量: 蛋白勻漿液 0． 02mL，10mmol /L pH7． 16 磷酸鹽緩沖液1． 43mL，10mmol /L 2，4-二硝基氯苯( CDNB) 0． 05mL，50U/mL谷胱甘肽巰基( GST) 0． 02mL; 標(biāo)準(zhǔn)管加 3． 11mmol /L 還原型谷胱甘肽( GSH) 0． 02mL，于 340nm 處測(cè)其光密度。

1． 2． 5． 2 丙二醛的測(cè)定 分別于培養(yǎng) 12，24，48h 取出大鼠晶狀體，用 0 ～ 4℃ PBS 充分沖洗，再用濾紙吸干后稱質(zhì)量，以 1g 組織加入 9mL 11． 5g /L 氯hua鉀液為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行勻漿。在不同試管中依次加入不同晶狀體勻漿液 0． 2mL，80g /L 十二烷基硫酸鈉 0． 2mL，200mL /L 醋酸 1． 5mL 及8g /L 硫代巴 比 妥 酸 1． 5mL，用 雙 蒸 餾 水 調(diào) 節(jié) 終 體 積 至4mL。95℃水浴加熱 60min。取出冷卻后，加入 3． 5mL 正丁醇與吡啶的混合液( 兩液體體積比為 15∶ 1) ，振搖后提取有機(jī)層，以四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)，在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng) 515nm，發(fā)射光波長(zhǎng) 553nm，計(jì)算 MDA 的量。

1． 2． 5． 3 晶狀體超氧化物歧化酶的測(cè)定 分別于培養(yǎng) 12，24，48h 取出大鼠晶狀體，用0 ～ 4℃ PBS 充分沖洗，再用濾紙吸干后稱質(zhì)量，用旋渦混勻器充分混勻，置 37℃ 恒溫水浴 40min，將各管混勻，室溫放置 10min，于波長(zhǎng) 550nm 處，1cm 光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色測(cè)各管 OD 值。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析: 數(shù)據(jù)用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s) 表示，采用SPSS 10． 0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和多樣本比較的秩和檢驗(yàn)，以 P ＜ 0． 05 作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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