avav588con,最近2019中文免费字幕在线观看,欧美一道本一区二区三区,九九热在线观看,经典好看免费AV

白藜蘆醇與伊馬替尼協(xié)同作用對 Ｋ５６２
細(xì)胞生物學(xué)行為的影響＊
王曉軍１ 茹甫毅１ 吳雙有１ 朱衛(wèi)民１ 田培軍１

［摘要］ 目的：探討白藜蘆醇對人白血病細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法：采用不同濃度白藜蘆醇及伊馬替尼對 Ｋ５６２細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，通過 ＭＴＴ法、臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞增殖，ｃａｓｐａｓｅ－３活 性 檢 測、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色 及 流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞增殖抑制率，利用中效原理計算出各時間段內(nèi)白藜蘆醇、伊馬替尼對 Ｋ５６２細(xì)胞增殖抑制的中效濃度，以檢測二者有無聯(lián)合增效作用。結(jié)果：不同劑量白藜蘆醇、伊馬替尼單獨(dú)作用和聯(lián)合作用對 Ｋ５６２細(xì)胞均有生長抑制作用，在一定范圍內(nèi)呈劑量、時間依賴性，２種藥物聯(lián)合有協(xié)同增效作用。隨著白藜蘆醇或伊馬替尼濃度升高，其ｃａｓｐａｓｅ－３活性逐漸增強(qiáng)。白藜蘆醇、伊馬替尼單獨(dú)作用和聯(lián)合作用對人白血病細(xì)胞 Ｋ５６２均 有 凋 亡 作 用，且聯(lián)合用藥組隨著白藜蘆醇或伊馬替尼濃度的增加，Ｋ５６２細(xì)胞的凋亡率也逐漸增 加。
結(jié)論：白藜蘆醇及伊馬替尼對白血病 Ｋ５６２細(xì)胞株均有促進(jìn)凋亡作用，聯(lián)合用藥可明顯增加其凋亡率。
［關(guān)鍵詞］ 白血病；白藜蘆醇；伊馬替尼；凋亡白藜蘆醇本質(zhì)是一種活性非黃酮多酚化合物的新型抗癌 劑，近年研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對ru腺癌、前列腺癌、皮膚癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長均具有顯著的抑制作用，同時也對人白血病細(xì)胞具有明顯抑制生長作用，是非常有前景的天然抗腫瘤藥物。但是其抑制腫瘤細(xì)胞生長的具體機(jī)制比較復(fù)雜，文獻(xiàn)＊ 基金項(xiàng)目：陜西省衛(wèi)生科研項(xiàng)目（Ｎｏ：Ｄ８０） １安康市中心醫(yī)院（陜西安康，７２５０００）通信作者：茹甫毅，Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｙａｎｆｏｒｅ＠１２６．ｃｏｍ報道較少。為了解白藜蘆醇在抗白血病中的作用，我們觀察了白藜蘆醇對人白血病細(xì)胞 Ｋ５６２生長的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

１ 材料與方法
１．１ 材料
１．１．１ 細(xì)胞株 人白血病 Ｋ５６２細(xì)胞株購自南京科佰生物科技有限公司。
１．１．２ 細(xì)胞培養(yǎng)液 本實(shí)驗(yàn)所用 ＲＰＭＩ－１６４０細(xì)胞培養(yǎng) 液 含 有 １０％ 滅 活 胎 牛 血 清，１００ Ｕ／ｍＬ 青 霉素，１００Ｕ／ｍＬ鏈霉素。· ５０７ ·臨床血液學(xué)雜志 第３０卷
１．１．３ 主要試劑 ＲＰＭＩ－１６４０細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國 Ｇｉｂｃｏ公司；臺盼藍(lán)購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；ＭＴＴ 檢 測 試 劑 盒 購 自 Ａｍｒｅｓｃｏ公 司；白 藜蘆醇購自西安奧特斯生物制品有限公司；伊馬替尼（瑞士 ＮＯＶＡＲＴＩＳ公司）；ｃａｓｐａｓｅ－３活性檢測試劑
盒購自 Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司。
１．２ 方法
１．２．１ 實(shí)驗(yàn)分組 將 Ｋ５６２細(xì)胞株分為空白對照組、伊馬替尼單藥組（０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌ）、白藜蘆 醇單藥組（５０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌ）、伊馬替尼聯(lián)合白 藜蘆醇 組 （伊 馬 替 尼 ０．１ μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 ５０μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．１μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 １００μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．１μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 ２００μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．２ μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 ５０μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．２μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 １００μｍｏｌ／Ｌ、伊 馬 替 尼 ０．２μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 蘆 醇 ２００μｍｏｌ／Ｌ）。上述每組細(xì)胞均設(shè)置６個復(fù)孔。１．２．２ 藥品制備 白藜蘆醇及伊馬替尼片劑分別采用二甲基亞砜進(jìn)行溶解，按濃度為１０ｍｇ／ｍｌ配制原液，在生理鹽水稀釋，稀釋濃度為２０μｍｏｌ／Ｌ。另外２５０ｍｇ的 ＭＴＴ 粉劑溶于５０ｍｌｐＨ 為７．４的 ＰＢＳ液 中。所 有 液 體 均 過 濾 分 裝，保 存 條 件 為－２０℃。
１．２．３ 細(xì)胞培養(yǎng) 將 Ｋ５６２細(xì)胞培養(yǎng)在含１０％胎牛血清、１００ Ｕ／ｍＬ 青 霉 素、１００ｐｇ／ｍＬ 鏈 霉 素 和２ｍｍｏｌ／Ｌ谷 氨 酰 胺 的 ＲＰＭｌ－１６４０ 培 養(yǎng) 液 內(nèi)，于３７５％ＣＯ２ 飽 和 濕 度 條 件 下 培 養(yǎng)，每２～３ｄ傳代１次。細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用于實(shí)驗(yàn)。１．２．４ ＭＴＴ 法檢 測 細(xì) 胞 增 殖 收集對數(shù)生長期的 Ｋ５６２細(xì)胞于３７℃、５％ＣＯ２ 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于２４、４８、７２ｈ時加入２０μｌＭＴＴ 溶液（５ｍｇ／ｍｌ），繼續(xù)于３７℃、５％ＣＯ２ 培養(yǎng)箱中孵育４ｈ，隨后棄掉 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 液；向 每 個 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 孔 中 分 別 加 入１５０μｌＤＭＳＯ，用脫色搖床振蕩１０ｍｉｎ，隨后用酶聯(lián)免疫檢測儀，使結(jié)晶物充分溶解；選擇５７０ｎｍ 波長（Ａ５７０），以空白孔調(diào)零，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光度并記錄結(jié)果，計算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率＝１－實(shí)驗(yàn)孔Ａ５７０／對照孔Ａ５７０。１．２．５ 臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn) 按照１．２．１中的分組將相應(yīng)藥物加 入 至 各 組 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 孔 中，作 用４８ｈ后用移液器吹打細(xì)胞使之制成單細(xì)胞懸液；將各組細(xì)胞懸液作適當(dāng)稀釋后用臺盼藍(lán)進(jìn)行染色，具體操作為細(xì)胞懸液與０．４％臺盼藍(lán)溶液按照９∶１比例混合均勻，隨后在３ｍｉｎ內(nèi)用細(xì)胞計數(shù)板統(tǒng)計活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)；選擇各組作用的zui佳濃 度，分 別 用該濃度作用于 Ｋ５６２細(xì)胞，并分別于２４、４８、７２ｈ時檢測細(xì)胞的存活率。

１．２．６ 中效濃度的計算 存活率（ｆｕ）＝藥物實(shí)驗(yàn)組Ａ 值／細(xì)胞對照組Ａ 值，抑制率（ｆａ）＝１－存活率（ｆｕ）。將中效方程ｆａ／ｆｕ＝（Ｄ／Ｄｍ）ｍ 兩邊取對數(shù)，得ｌｇ（ｆａ／ｆｕ）＝ｌｇ（Ｄ／Ｄｍ）ｍ＝ｍｌｇＤ－ｍｌｇＤｍ。設(shè)ａ＝－ｍｌｇＤｍ、Ｙ＝ｌｇ（ｆａ／ｕ）、Ｘ＝ｌｇＤ，則 Ｙ＝ｍＸ＋ａ。其中 Ｄ為藥物濃度，Ｄｍ 為中效濃度，即抑制率為５０％時的藥物濃度（ＩＣ５０），ｍ 為斜率，ａ為截距。

１．２．７ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色 實(shí) 驗(yàn) 收 集 細(xì) 胞，ＰＢＳ洗，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色３７℃ ３０ｍｉｎ，制 片 熒 光 顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)變化并拍照。
１．２．８ Ｃａｓｐａｓｅ－３活性 檢 測 細(xì) 胞 按ｃａｓｐａｓｅ－３試劑盒的要求處理，參考 Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司的ｃａｓｐａｓｅ－３酶活力單位的定義，即一個酶活力單位表示為當(dāng)?shù)孜?處 于 飽 和 狀 態(tài) 下 時，在 ３７℃１ｈ 內(nèi) 可 以 剪 切１ｎｍｏｌ Ａｃ－ＤＥＶＤ－ｐＮＡ 產(chǎn) 生 １ ｎｍｏｌ ｐＮＡ 的ｃａｓｐａｓｅ－３酶量，由此就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的ｃａｓｐａｓｅ－３。
１．２．９ 流 式 細(xì) 胞 術(shù)（ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ雙 染 色法）檢測各組細(xì)胞凋亡情況 通過血清饑餓法對Ｋ５６２細(xì)胞行同步化處理，各組藥物作用４８ｈ后收集對數(shù)生 長 期 的 Ｋ５６２細(xì) 胞，ＰＢＳ 洗 滌 ３ 次，加 入５μｌ的 ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ和１μｌ的 ＰＩ混均，避光孵育１０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗滌１次，每管加入４００μｌ的ＰＢＳ，采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。
１．３ 統(tǒng)計學(xué)處理
數(shù)據(jù) 均 使 用 Ｅｘｃｅｌ表 格 進(jìn) 行 錄 入，同 時 采 用ＳＰＳＳ２０．０軟 件 對 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 統(tǒng) 計 學(xué) 分 析。數(shù) 據(jù) 以ｘ珚±ｓ表示，兩樣本間的平均數(shù)比較使用獨(dú)立樣本ｔ檢驗(yàn)，多 組 樣 品 間 的 均數(shù) 比 較 使 用 單 因 素 方 差 分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝０．０５。

......想閱讀文獻(xiàn)全文，可點(diǎn)擊下載或者聯(lián)xi我司業(yè)務(wù)員領(lǐng)取！我司正在進(jìn)行“積分換豪禮”，“預(yù)存返現(xiàn)”，“推薦享現(xiàn)金紅包”等優(yōu)惠活動，詳情可lai電咨詢我司業(yè)務(wù)員！