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技術(shù)支持-免疫組化技術(shù)要點(diǎn)
閱讀：1412 發(fā)布時(shí)間：2013-7-16實(shí)驗(yàn)過程中，常見的免疫組化技術(shù)要點(diǎn)有哪些？上海恒遠(yuǎn)生物為您總結(jié)：歡迎大家給予詳細(xì)的觀點(diǎn)參數(shù)。
1. 固定
用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購置前注意說明書。
（1）BouinS固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。
（2）PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。
2. 組織脫水、透明
時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則在切片時(shí)容易碎片，切不完整。
3. 切片時(shí)展片
有些組織在切片后難以在水中展開，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?br />4. 烤片
60℃ 30分鐘或37℃ 過夜，溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)，抗原容易丟失。
5. 蠟塊及切片的保存
在4℃保存
6. 脫片問題
Poly-L-Lysine（多聚賴氨酸）為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。
7. 滅活內(nèi)源性酶
（1）HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活
（2）AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。
8. 暴露抗原
對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度（不同抗體的*修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說明書）。對(duì)于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。
9. 封閉
在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉
10. 抗體稀釋
應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。
11. 背景高
在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。
12. 返藍(lán)
在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。
13. 顯色
一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。
14. 在整個(gè)操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會(huì)有非特異性染色。
15. 拍照
免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測(cè)量其灰度應(yīng)在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動(dòng)白平衡在起作用。另外一個(gè)因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。
這是一套完整的免疫組化技術(shù)要點(diǎn)，由恒遠(yuǎn)生物技術(shù)部發(fā)表，我司代理免疫組化產(chǎn)品近千種，生化試劑上萬種，咨詢您所需科研產(chǎn)品，我司提供完善的售前售后指導(dǎo)，為您的實(shí)驗(yàn)解決一切麻煩。咨詢上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購置前注意說明書。
（1）BouinS固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。
（2）PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。
2. 組織脫水、透明
時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則在切片時(shí)容易碎片，切不完整。
3. 切片時(shí)展片
有些組織在切片后難以在水中展開，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?br />4. 烤片
60℃ 30分鐘或37℃ 過夜，溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)，抗原容易丟失。
5. 蠟塊及切片的保存
在4℃保存
6. 脫片問題
Poly-L-Lysine（多聚賴氨酸）為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。
7. 滅活內(nèi)源性酶
（1）HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活
（2）AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。
8. 暴露抗原
對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度（不同抗體的*修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說明書）。對(duì)于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。
9. 封閉
在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉
10. 抗體稀釋
應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。
11. 背景高
在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。
12. 返藍(lán)
在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。
13. 顯色
一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。
14. 在整個(gè)操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會(huì)有非特異性染色。
15. 拍照
免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應(yīng)盡可能呈現(xiàn)純白色。測(cè)量其灰度應(yīng)在250左右。如果呈現(xiàn)淡藍(lán)色，一般是相機(jī)自動(dòng)白平衡在起作用。另外一個(gè)因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍(lán)。