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恒遠(yuǎn)告訴大家：關(guān)于WB實驗的常見問題以及解決方案（5）
閱讀：3143 發(fā)布時間：2012-8-22
上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司是一家生物技術(shù)企業(yè)，主要從事免疫學(xué)、分子生物學(xué)和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷售。并代理銷售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國外，致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù)，滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實驗需求。
41、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？
答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。
42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？
答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了，可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。
43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）.
44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。
答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯的選擇。
45、是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？
答：對于發(fā)表文章的實驗加內(nèi)參，實驗嚴(yán)謹(jǐn)。
46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？
答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。
47、做半定量Western Blot，內(nèi)參β-actin，GAPDH哪個好？
答：選用beta-actin就可以。
48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？
答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。
49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBSTzui后那個T是Tween嗎，濃度多大？
答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 （TBST）, NaCl：8g， Tris base：2.42g加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L。
答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑。
42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？
答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了，可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。
43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？
答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）.
44、我用的是可視marker，但是電泳總跑不全8條帶，請問什么原因？怎樣改善？膠用過8％，10％，12％，都是這樣。marker是新買的。
答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯的選擇。
45、是否Western Blot實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？
答：對于發(fā)表文章的實驗加內(nèi)參，實驗嚴(yán)謹(jǐn)。
46、核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？
答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。
47、做半定量Western Blot，內(nèi)參β-actin，GAPDH哪個好？
答：選用beta-actin就可以。
48、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？
答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。
49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBSTzui后那個T是Tween嗎，濃度多大？
答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 （TBST）, NaCl：8g， Tris base：2.42g加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 調(diào)節(jié)pH 至 7.4, 加水定容至 1L。
50、封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在4度下?
答：均可在室溫進(jìn)行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個小時，然后4度過夜。
如果你想了解更多關(guān)于western blot的信息，來函！
答：均可在室溫進(jìn)行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個小時，然后4度過夜。
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