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盛夏干貨分享:ELISA樣本準備*指南
閱讀：1332 發(fā)布時間：2020-7-22 進行 ELISA 前制備樣品的提示
請參閱隨試劑盒提供的實驗方案，了解有關(guān)樣品制備和兼容性樣品類型的產(chǎn)品特定詳細信息。
該指南適用于制備 ELISA 測定法中用到的常規(guī)樣本，而好的樣品制備程序可根據(jù)所需測定靶標及測定方法作相應(yīng)調(diào)整。選用新測定方法時，建議查閱相關(guān)文獻選擇與您樣本相似的實驗步驟作為參考。
樣品制備方法
一、細胞培養(yǎng)物上清液
1.將細胞培養(yǎng)上清移至離心管，4℃，1,500 rpm 離心 10 分鐘。
2.立即進行上清液的分裝并于 -80℃ 保存。避免反復(fù)凍融。
二、細胞提取物
1.將細胞培養(yǎng)板放置在冰上。
2.吸出培養(yǎng)基并用預(yù)冷 PBS 輕輕漂洗細胞一次。
3.棄去 PBS ，向 100 mm 培養(yǎng)板加入 0.5ml 提取緩沖液。
4.收集細胞，然后移至經(jīng)過預(yù)冷的離心管中。
5.短暫渦旋后冰上孵育 15-30 分鐘
6.4℃ 13,000 rpm 離心 10 分鐘，沉淀不溶性內(nèi)容物。
7.將上清（這里是指可溶性細胞提取物）分裝至預(yù)冷的離心管中，并于 -80℃ 保存。盡可能減少反復(fù)凍融次數(shù)。
三、條件培養(yǎng)基
1.將細胞接種到含*（含血清）生長培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器中，使細胞增殖達到預(yù)期的融合度。
2.棄去培養(yǎng)基，用預(yù)溫 PBS 小心洗滌。重復(fù)洗滌步驟。
3.棄去 PBS 洗滌液并小心加入無血清培養(yǎng)基。
4.孵育 1-2 天。
5.將培養(yǎng)基移至離心管，4℃ 1,500 rpm 離心 10 分鐘。
6.立即分裝上清并于 -80℃ 保存。避免反復(fù)凍融。
四、乳汁
1.收集樣品，10,000 x g 4℃離心 2 分鐘。
2.分裝上清液并于 -80℃ 保存。避免反復(fù)凍融。
五、血漿
1.將全血收集到含抗凝劑的管中，例如 BD 抗凝真空采血管（目錄號：363080/363080）或添加 0.1M 檸檬酸鈉至 1/10 終體積。
2.4℃ 3,000 rpm 離心 10 分鐘。
3.立即分裝上清（血漿）并于 -80℃ 保存。避免反復(fù)凍融。
六、尿液
1.收集樣品，10,000 xg 4℃離心 2 分鐘。
2.分裝上清并于 -80℃ 保存。避免反復(fù)凍融。
七、唾液
1.收集樣品，4℃ 10,000 xg 離心 2 分鐘。
2.立即分裝上清并于 -80℃ 保存。避免反復(fù)凍融。
八、血清
1.將全血收集到未經(jīng)處理的測試管中，或者到不含抗凝劑的管中，如 BD 血清用真空采血管。
2.室溫孵育 20 分鐘。
3.4℃ 3,000 rpm 離心 10 分鐘。
4.立即分裝上清（血清）并于 -80℃ 條件下保存。避免反復(fù)凍融。
九、組織提取物
1.用干凈的工具解剖組織，best在冰上、盡快進行，以防止被蛋白酶降解。
2.將組織置于圓底的微量離心管中，并浸入液氮中 “速凍”。將樣品保存在 -80℃ 以便后續(xù)使用或放置在冰上進行直接勻漿。
3.對于約 5 mg 的組織塊，可向管中添加約 300 µl *提取緩沖液（查看細胞/組織提取緩沖液配方），然后用電動勻漿器勻漿。
4.清洗刀片兩次，每次清洗使用 300µl *提取緩沖液，然后在 4℃ 下維持恒定攪拌 2 小時（例如置于冷室中的回旋振蕩器上）。
5.4℃ 13,000 x rpm 離心 20 分鐘。置于冰上，將上清液（這里是指可溶的蛋白質(zhì)提取物）分裝至新、預(yù)冷的管中并在 -80℃ 保存。避免反復(fù)凍融。
裂解緩沖液的體積必須根據(jù)所用組織的量進行確定。終蛋白質(zhì)提取物的濃度一般 > 1 mg/mL。
細胞/組織提取緩沖液配方：
100 mM Tris，pH 7.4
150 mM NaCl
1 mM EGTA
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.5% 脫氧膽酸鈉
制備*提取緩沖液所需的其它試劑：
磷酸酶抑制劑混合物
蛋白酶抑制劑混合物
PMSF
使用前，按照廠家描述加入磷酸酶和蛋白酶抑制劑混合物以及終濃度為1mM的PMSF。
通用建議
1.推薦的蛋白質(zhì)提取物濃度為至少 1-2 mg/mL。
2.通常，可用緩沖液將血清、血漿、細胞和組織提取物稀釋2倍。
3.樣品融化后，使用前，將樣品在 4℃ 10,000 x rpm 離心 5 分鐘以除去沉淀。