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    想要流式的染色結(jié)果好，必須用單細胞懸液，細胞團和細胞碎片容易堵塞進樣管。從固態(tài)組織樣本中制備單細胞懸液需要借助機械分離和（或者）酶消化。操作條件和酶的選擇等需要根據(jù)經(jīng)驗進行一定的調(diào)整。以下是將四種常見的流式樣本制備成單細胞懸液的方法

 

一：組織培養(yǎng)細胞

? 所需試劑器皿：

1、 Accutase酶 (eBioscience Cat#00-4555)

2、 流式染色緩沖液（eBioscience Cat#00-4222）

3、 15或50ml離心管

? 實驗步驟：

1、 對于懸浮生長的細胞，將細胞轉(zhuǎn)移至離心管中，進行計數(shù)和活力分析后進入第3步；

2、 對于貼壁生長的細胞系，我們推薦用Accutase酶將細胞從培養(yǎng)皿中消化下來并分離聚集細胞。將細胞轉(zhuǎn)移至離心管中進行計數(shù)和活力分析后進入第3步（注意：Accutase酶會改變某些細胞的表面抗原表位）；

3、 離心后，將細胞用流式染色緩沖液重懸至細胞濃度為2*10^7/ml。
 

二、淋巴組織細胞

一般來說機械分離淋巴組織足夠?qū)⒓毎尫艦閱渭毎麘乙骸?/span>

? 所需試劑器皿：

1、60mm×15mm的組織培養(yǎng)皿

2、3ml注射器

3、細胞過濾器（尼龍濾網(wǎng)）

4、流式染色緩沖液（eBioscience Cat#00-4222）

5、15或50ml離心管

? 實驗步驟：

1、 將獲得的組織（脾臟、淋巴結(jié)、胸腺）放入到組織培養(yǎng)皿中，用3ml注射器活塞加壓的方法把組織分散為單細胞懸液（或者可以在10ml流式染色緩沖液總用兩片載玻片把組織壓成糊狀）；

2、 用10ml流式染色緩沖液收集細胞，并將細胞懸液通過過濾器以除去細胞團和細胞碎片。將懸液收集到離心管中；

3、 4℃，300-400g離心細胞懸液4-5min，去除上清液；

4、 重懸沉淀細胞并做計數(shù)和活力分析；

5、 重復(fù)步驟3后，將細胞用流式染色緩沖液重懸至細胞濃度為2*10^7/ml。

 

三、非淋巴組織細胞

? 所需試劑器皿：

1、 剪刀或手術(shù)刀片

2、 PBS或其他合適的生理緩沖液

3、 60mm×15mm的組織培養(yǎng)皿

4、 3ml注射器

5、 細胞過濾器（尼龍濾網(wǎng)）

6、 流式染色緩沖液（eBioscience Cat#00-4222）

7、 15或50ml離心管

? 實驗步驟：

1、 將組織用剪刀或手術(shù)刀片弄成2-4mm大小的碎塊；

2、 加入用PBS稀釋的適量的酶，zui合適孵育的時間和溫度參考所用酶的操作說明書（注意：酶的種類取決于組織的類型；

3、 用移液槍輕輕吹打分散細胞后，用過濾器過濾除去細胞團和碎片，收集細胞懸液至離心管中；

4、 4℃，300-400g離心細胞懸液4-5min，去除上清液；

5、 用PBS重懸細胞，去除多余的酶溶液；

6、 按步驟4的方法離心；

7、 重復(fù)步驟5和6；

8、 用流式染色緩沖液重懸細胞，并進行計數(shù)和活力分析；

9、 按步驟4的方法離心，將細胞用流式染色緩沖液重懸至細胞濃度為2*10^7/ml。

 

四、從全血中分離PBMC

? 所需試劑器皿：

1、 PBS

2、 Ficoll或者其他密度梯度分離液

3、 流式染色緩沖液（eBioscience Cat#00-4222）

4、 15或50ml離心管

? 實驗步驟：

1、 將全血用PBS 1:1在錐形管中稀釋；

2、 在稀釋的樣本上面加入等體積的Ficoll；

3、 1000g離心20min;

4、 將位于PBS和Ficoll層間的PBMC轉(zhuǎn)移到一個新的管中；

5、 加入PBS清洗細胞；

6、 4℃，300-400g離心細胞懸液4-5min，去除上清液；

7、 用流式染色緩沖液重懸沉淀細胞并做計數(shù)和活力分析；

8、 重復(fù)步驟6后，將細胞用流式染色緩沖液重懸至細胞濃度為2*10^7/ml。