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【原理】

ELISA雙抗體夾心法的原理是將特異性抗體結(jié)合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后再加酶標記抗體，與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量?，F(xiàn)上海恒遠生物科技有限公司技術(shù)以檢測HbsAg為實例為您詳細講解。

 

【材料】

酶標抗體（HRP-抗HBs-IgG）、抗HBs-IgG、待檢血清

包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB

稀釋液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液

底物液 0.1 mol/L Na2HPO4（Na2HPO4?12H2O 35.8 g/L）5.14 ml，0.05 mol/L枸櫞酸（10.5g/L）4.86 ml混勻，加入鄰苯二胺（OPD）4 mg，置棕色小瓶中，臨用時加30% H2O2 4.0μl，混勻。

終止液 2 mol/L H2SO4

溫箱、酶標反應(yīng)板、酶標分光光度計

 

【方法】

1． 包被 取包被液適當稀釋的抗HBS-IgG 0.1 ml，加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中。加蓋，4℃ 24h。次日用洗滌液充分洗滌3次，甩干。

2． 各孔內(nèi)加不同稀釋倍數(shù)的待檢血清0.1 ml，同時加陽性和陰性對照血清，置43℃溫箱60 min，移去液體。同前法洗滌3次，甩干。

3． 各孔內(nèi)加稀釋HRP-抗HBs-IgG 0.1 ml，置43℃溫箱60 min。移去液體，同前法洗3次，甩干。

4． 各孔加底物液0.1 ml，置黑暗處20 min。

5． 各孔內(nèi)加2 mol/L H2SO4 0.05 ml，終止反應(yīng)。

 

【結(jié)果】

1． 目測法 陽性孔呈桔黃色，陰性孔無色或極淺黃色。

2． 比色法 用酶標分光光度計測A492nm，計算P/N值（為待測血清A492nm和陰性對照A492nm的比值）。如P/N2.1，結(jié)果為陽性，否則為陰性。

ELISA簡便、敏感、特異。并酶標記抗體試劑制備容易、穩(wěn)定、有效期長、因此推廣很快，ELISA雙抗體夾心法，但僅適用于二價或二價以上的大分子抗原的檢測。