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今天上午，有位來自沈陽的于老師在我公司側面的在線客戶中咨詢問題。于老師主要咨詢的問題是：

    做ELISA間接法測試小鼠血清中的IgE抗體，設空白對照、和陰性對照、陽性血清稀釋倍數(shù)為5千、1萬、10萬、20萬不等，用的是生物素標記的羊抗鼠IgE抗體，和親和素的辣根過氧化物酶，可是結果出來后除了空白對照孔沒有顏色外，其余各孔全有顏色，而且OD值都相差不大，開始以為是污染可是連續(xù)重復N遍后結果還是這樣，而且發(fā)現(xiàn)凡是有用抗原包被過孔全都呈現(xiàn)陽性，難道真的是污染造成的嗎？如果真的是污染那為什么各個孔的OD值都很平均呢？為什么我測IgG就呈現(xiàn)良好的梯度呢？（注明：我測IgG用的是普通的二抗和辣根過氧化物酶，不是生物素的二抗和親和素的辣根；另外我是手工洗板，每次甩完板后在濾紙上拍干）

    是不是生物素二抗和親和素辣根過氧化酶過于靈敏造成的污染呢？請教高手指點，如果是污染該怎樣避免呢，請指教?。▽嶒炇覜]有洗板機）我已經做了快10天了用盡了辦法都是這樣，實驗又要趕進度，每天都在做無用功……

    吳收到后，*時間將問題內容轉述給了公司技術員，上海恒遠技術員分析道，你以前測IgG有良好的梯度，而現(xiàn)在測IgE梯度不明顯，它們的差別在于測IgG是用HRP標記的二抗，而測IgE用生物素標記的二抗。在排除你的ELISA操作不熟練出現(xiàn)問題的情況下，您可以考慮以下因素：

    1.是否是生物素標記的二抗有問題？是進口貨還是國產貨？檢驗生物素標記的二抗有無問題，可以將二抗稀釋成不同濃度，然后用底物使之顯色，簡單的說就是給二抗做個方陣，看看它的顯色及靈敏度；

    2.你一抗稀釋的zui大倍數(shù)是多少倍？你做方陣時，可以把一抗稀釋的梯度拉大一些，如果現(xiàn)在做到20萬倍稀釋，還可以繼續(xù)往下，比如40萬、80萬、160萬……因為如果一抗的濃度非常大，效價很高的話，那么肯定是需要稀釋到很大的一個倍數(shù)后顯色才會有明顯梯度出現(xiàn)。

    3.你的空白孔有沒有包被抗原？如果包被抗原了，但結果不顯色則說明你的包被封閉等操作都沒問題；如果沒有包被抗原直接封閉的，zui后不顯色，那說明二抗沒有什么非特異性吸附。

    4.如果陰性對照也顯色，那抗原的用量可能比較大了，再往下稀釋。

    5.洗板也要注意，盡量勿加滿孔，小心串孔。

    經過一系列分析解答之后，我公司技術員還表示：ELISA是很粗略的又很靈敏的體系，實驗結果需根據操作情況來分析原因。