ELISA試劑盒檢測(cè)儀器

一、ELISA試劑盒的基本應(yīng)用方法

方法一　用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: 

1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。 

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。 

3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。 

4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 

5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 

6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。

方法二　用于檢測(cè)未知抗體的間接法：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。 

加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照) 
于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。 
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

二、　試劑器材

1.　試劑

(1)　包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

NaHCO３   1.59克

NaHCO３　 2.93克

加蒸餾水至1000ml

(2)　洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M

KH2PO4 　　　　　0.2克

Na2HPO４·12H2O　　2.9克

NaCl　　　　　　　8.0克

KCl　　　　　　　　0.2克

Tween-20　0.05％　0.5ml

加蒸餾水至1000ml

(3)　稀釋液：

牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

加洗滌緩沖液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。

(4)　終止液(2M　H２SO４）：

　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。

(5)　底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

0.2M Na２HPO４(28.4克／L) 25.7ml

0.1M 檸檬酸(19.2克／L)　　　　　 24.3ml

加蒸餾水50ml。

(6)　TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:

TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml

底物緩沖液(PH5.5)　　　 10ml

0.75％H２O２　　 　32μl

(7)　ABTS使用液:

ABTS　　　　　　　　0.5mg

底物緩沖液(PH5.5)　 1ml

3％H２O２　 　2μl

(8)　抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

(9)　正常人血清和陽(yáng)性對(duì)照血清。

2.　器材:

(1)　聚苯乙烯塑料板(簡(jiǎn)稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測(cè)儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

(2)　小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

(3)　4℃冰箱，37℃孵育箱。酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA試劑盒法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。