生長培養(yǎng)基結(jié)合蛋白

1.100ml 含重組表達質(zhì)粒的菌體誘導(dǎo)后，離心5000g×5min，棄上清，收獲菌體，用10ml預(yù)冷的B/W緩沖液重懸。

2. 重懸液于冰上超聲處理，直至樣品不再粘稠，4℃離心 14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽濾后作為樣品液。

3. 將結(jié)合T7•Tag抗體的瓊脂充分懸起，平衡至室溫，裝入層析柱中。

4. B/W緩沖液平衡后樣品液過柱。

5. 10ml B/W緩沖液過柱，洗去未。

6. 用5ml洗脫緩沖液過柱，每次1ml，洗脫液用含150μl中和緩沖液的離心管收集，混勻后置于冰上，直接SDS-PAGE分析。

7. 將洗脫下來的蛋白放入透析袋中，雙蒸水透析24hr，中間換液數(shù)次。

8. 用PEG 20000濃縮蛋白。

1. 混合10ml全血和10ml RPMI 1640 生長培養(yǎng)基
RPMI 1640 800ml
FBS 200ml
2mmol/L L-谷氨酰胺
5μg/ml 兩性霉素
50μg/ml 慶大霉素

2. 取15ml無菌離心管，加3ml Histo-paque1077（Sigma），在其上加4ml稀釋血，分離淋巴細胞。
3. 室溫300g 離心30min，棄上層清亮血漿。
4. 收集不透明的淋巴細胞層，細胞懸液倒入50ml無菌離心管。
5. 20ml RPMI 1640生長培養(yǎng)基洗2次，室溫300g離心10min。
6. 10ml血鋒利的細胞懸于1.0ml含EB病毒的上清。含EB病毒上清來自絹猴細胞系B95-8（ATCC提供）的限制培養(yǎng)基，含EB病毒的B95-8限制培養(yǎng)基用前應(yīng)過濾[(0.22μm無菌濾膜（Corning）]，避免污染絹猴細胞。
B95-8絹猴細胞產(chǎn)生高滴度感染性EB病毒，應(yīng)在P2實驗室中作為生物毒劑操作。高密度絹猴細胞不更換或補加培養(yǎng)液溫育8天，收集上清，0.22μm無菌濾膜過濾，用于無限增殖的話，含EB病毒限制培養(yǎng)液4℃可貯存4-8周。
7. 細胞懸液（1.0ml）放入25cm2組織培養(yǎng)瓶，垂直放置，37℃ 5% CO2孵育1~3h。
8. 孵育后，加入3ml含0.2μg/ml 刀豆凝集素A的RPMI 1640生長培養(yǎng)基，水平放置，使細胞均勻分布于全生桌面。隔幾天觀察一次細胞生長狀況，集落的形成標(biāo)志著細胞已無限增殖化。
9. 每周加1ml含刀豆凝集素A的新鮮RPMI 1640生長培養(yǎng)基，不要吸出原培養(yǎng)基。