HLA抗原的檢測 HLA-A、B、C抗原可用血清學(xué)方法鑒定，故又稱SD抗原（serologically defined antigen）,常采用微量淋巴細胞毒性試驗（microlymphocytotoxicity test）,又稱補體依賴細胞毒試驗（complement dependent cytotoxicity,CDC）?；静襟E是分離純化外周血中的淋巴細胞，加一組已知HLA抗血清，20℃60分釧后，再加家兔補體，37℃ 60分釧后加臺盼蘭染色觀察結(jié)果，如淋巴細胞染成蘭色則為陽性，表明待檢淋巴細胞表面具有與已知抗血清相應(yīng)的抗原。也可用51Cr標(biāo)記的細胞毒試驗。

　　　　HLA-DR、DQ抗原檢測的基本方法是采用微量淋巴細胞毒性試驗。先從待檢者外周血中分離純B細胞，陽性血清可來自經(jīng)產(chǎn)婦，但需用血小板吸收以除去抗HLA-A、B、C抗體。標(biāo)準(zhǔn)抗血清的主要有以下幾種來源。

　?。?）經(jīng)產(chǎn)婦血清：在多胎的婦女中，可得到抗HLA-A、B和C抗原的抗血清。因為胎兒的HLA抗原包含了父方抗原（因其中一個單倍體來自父方），在分娩時，由于胎盤損傷等原因，胎兒的父方抗原免疫了母方，從而在母體內(nèi)產(chǎn)生抗HLA抗血清，這種抗血清可能具有多種特異性，但多胎后，其中免疫原性zui強的一種抗原可刺激誘導(dǎo)得到單一特異性抗血清。　　HLA抗原的檢測

　?。?）計劃免疫志愿者的血清：給志愿者注射不相容的HLA淋巴細胞，受者產(chǎn)生特異性HLA同種抗體，可用于HLA-A、B、C、DR和DQ分型。

　?。?）單克隆抗體：至今報道的大都是經(jīng)種間免疫（鼠抗人）獲得，小鼠免疫系統(tǒng)識別人HLA抗原所產(chǎn)生的鼠抗人單抗不同于從經(jīng)產(chǎn)婦獲得的HLA抗血清，HLA抗原分子zui易為鼠免疫系統(tǒng)識別的暢敘有種間送別的決定簇，

　　所以應(yīng)用鼠雜交瘤技術(shù)獲得HLA單抗大部分都是識別種間差異的共同決定簇，所謂單態(tài)性HLA單抗。已獲得數(shù)百種HLA單抗中，僅少數(shù)為多態(tài)性HLA-A、B、C單抗。而在已獲得的多態(tài)性單抗中也集中某幾個少數(shù)的特異性抗原，要獲得多數(shù)特異HLA單抗有賴于人-人雜交瘤技術(shù)的應(yīng)用。第11次IHW報道用克隆的HLA等位基因轉(zhuǎn)染小鼠L細胞，獲取特異HLA抗原專一表達相應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染細胞（transfactent）以篩選相應(yīng)的HLA單克隆抗體?，F(xiàn)已從70多個轉(zhuǎn)染細胞中獲得抗HLA多態(tài)部分的單抗約50多種，特別針對難以檢出的DP以及部分DQ抗原的單抗，這些細胞和基因工程產(chǎn)生的制劑具有精細的分辨力，有助于確定各種HLA等位基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和各人群特異性抗原的檢測和分析。

　?。ㄈ〩LA-D抗原的檢測

　　以往HLA-D抗原用混合淋巴細胞培養(yǎng)（mixed lymphocyte culture）來鑒定，故又稱LD抗原（lymphocyte defined antigen），有雙向MLC和單向MLC兩種分型法。

　　1.雙向MLC 供者和受者淋巴細胞在體外共同孵育時，由于Lads抗原不同而相互刺激轉(zhuǎn)化為母細胞。供者和受者組織相容性愈差，相互刺激也愈強，轉(zhuǎn)化率就愈高。雙向MLC缺點是操作方法復(fù)雜，穩(wěn)定性與重復(fù)性差，一般要5-7天，對尸體供腎者多無法預(yù)先測定。

　　2.單向MLC 屬于陰性分型法，基本步聚是將已知HLA-D抗原的淋巴細胞用絲裂霉素C（mitomycin C）或X線照射處理，成為只有抗原激發(fā)能力而無增殖反應(yīng)能力的“刺激細胞”。將刺激細胞與末經(jīng)過這種處理的待測淋巴細胞進行混合培養(yǎng)，根據(jù)待測細胞出現(xiàn)母細胞反應(yīng)的程度，則可知待測淋巴細胞上是否具有與“刺激細胞”上相同的HLA-D抗原。在MLC起激發(fā)抗原的主要是B細胞和單核細胞上的D抗原，反應(yīng)細胞為CD4陽性T細胞。本法特點同雙向MLC。在單向MLC中作為刺激細胞用純合子配型細胞（homozygous typing cell,HTC）,因為純合子是兩個單體型*相同，因此只有一種D抗原。

　　純合子分型細胞的來源：

　?。?）姨姑表婚配的子女約占1/16的機率找到純合子細胞。

　　（2）多發(fā)性硬皮病患者中表現(xiàn)為HLA-D2和HLA-B7連鎖不平衡的個體具有異常高的純合子頻率。

　　（3）風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者D位點純合的發(fā)生率也較高。

圖6-12　姑姨表婚配的HLA單體型的遺傳模式圖

　　（四）HLA-DP抗原的檢測

　　HLA-DP抗原的檢測可采用預(yù)處理淋巴細胞分型試驗（primed lymphocyte typing test,PLT）基本步驟是首先取有一個單倍體相同的兩個個體的淋巴細胞進行混合培養(yǎng)，這在雙親與子女間很容易找到，如親代a/b,子代a/c。先將a/c經(jīng)X線照射作為刺激細胞，則反應(yīng)細胞a/b只對c單倍體抗原起反應(yīng)。經(jīng)9-14天混合培養(yǎng)，反應(yīng)細胞分裂增殖逐漸停止，zui后培養(yǎng)中留下已致敏的記憶細胞，稱為預(yù)處理細胞或PLT分型細胞，液氮保存。當(dāng)被檢者淋巴細胞含c單倍體抗原，則預(yù)處理細胞表現(xiàn)一種迅速的回憶反應(yīng)，在24-30小時內(nèi)迅速發(fā)生增殖。因此本法屬于陽性分型法。

　　（五）HLA的DNA分型及評述

　　　　HLA抗原的檢測1991年11月召開的11屆IHW上提出了HLA的DNA分型方法，使得HLA多態(tài)性的檢測有了突破性的進展，這些方法眾多，現(xiàn)列舉如下。

　　（1）PCR-ASO（或PCR-SSO）：即PCR技術(shù)與等位基因特異順序的寡核苷酸（allelic specific oligonucleotide,ASO）或順序待異性的寡核苷酸（sequence specific oligonucleotide,SSO）探針相結(jié)合的方法。用PCR技術(shù)擴增從需定型細胞中抽提出的高度多態(tài)性基因片段的DNA，再與特異的序列明確的寡核苷酸（SSO）探針雜交，可區(qū)分特定編碼區(qū)DNA順序的細微差別。

　?。?）PCR-RFLP：即PCR技術(shù)與限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment lengthpolmorphism,RFLP）分析技術(shù)相結(jié)合。HLA抗原多態(tài)性是由其編碼基因的堿基順序不同的結(jié)果。不同個體HLa DNA堿基順序的差別造成了限制性內(nèi)切酶切位點的不同，從而導(dǎo)致DNA電泳后限制性片段長度上的多態(tài)性。主要步聚是經(jīng)印跡法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后用已知的cDNA探針進行雜交，經(jīng)放射自顯影可查知相應(yīng)基因的何種長度的DNA酶切片段上。但此技術(shù)所用的內(nèi)切酶量大，方法復(fù)雜，耗費昂貴，已更先進、的以PCR為基礎(chǔ)的其它DNA分型所取代。

　?。?）PCR-SSCP：即PCR與單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism,SSCP）分析相結(jié)合的方法。其原理是單鏈DNA可形成穩(wěn)定的構(gòu)象，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中其遷移率不僅與鏈的大小有關(guān)，而且受鏈的核苷酸順序的影響。由于使用相同引物擴增產(chǎn)物長度-致因而單鏈DNA在電泳中的遷移格局反映了單鏈核苷酸組成的不同，可十分敏感地檢測等位基因間DNA順序的微小差別，目前此技術(shù)已應(yīng)用于DP等位點的分型。

　　盡管采用DNA水平的HLA分型工作有了很大進展，但血清學(xué)分型，特別對I類基因產(chǎn)物仍是分型基礎(chǔ)。在可以預(yù)見的時期內(nèi)，DNA分型是無法取代它的。但應(yīng)該強調(diào)，在第11次IHW及隨后召開的WHO-HLA命名委員均已早明，今后凡屬新HLA特異性必須有相應(yīng)的DNA序列為基礎(chǔ)，否則不再予以命名。

　　應(yīng)該看到，HTC與PLT在對HLA-D和HLA-DP特異性檢測上有過肯定的貢獻，但由于方法較為復(fù)雜，耗時費力，且影響因素多，程度有限，已逐漸被眾多DNA水平定型方法所取代?！　?span style="font-size: small">