細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測(cè)定

    1．PBMC的分離  通過(guò)淋巴細(xì)胞分層液分離PBMC，用含10％FCS、50~mol／L 2—巰基乙醇、1mmol／L丙酮酸鈉的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2X106／mL。

    2．細(xì)胞培養(yǎng)與收集  取6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加2mL細(xì)胞懸液，2gmol／L莫能菌素(monensin，抑制細(xì)胞分泌細(xì)胞因子)，l／~mol／L艾羅霉素(ionomycin)和20nS／mLPMA刺激細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。在37~C，5％C0)條件下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用不同的方法刺激細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。用4~CPBS洗細(xì)胞1次，留少許液體懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞*分散。

    3．細(xì)胞固定  于每管中加4％多聚甲醛(用pH7．4，0．1mmol／L磷酸緩沖液配制，置37℃預(yù)溫)3mL，充分混懸細(xì)胞，固定細(xì)胞5min。加入0．1％BSA-PBS 12mL，混勻以終止反應(yīng)。1 500r／rain離心lOmin，去上清后進(jìn)行封閉和染色(亦可用lmL含10％DMSO的PBS懸浮細(xì)胞，分裝保存于—80~C備用)。

    4．封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)  取上述固定的細(xì)胞(或復(fù)蘇凍存的細(xì)胞，用0。1％BSA—PBS洗滌細(xì)胞2次)，用懸浮液(含5％脫脂奶粉的PBS-Ca-Mg：1mmol／L Ca2+、1mmoL／LMg2+、0．1％皂角苷和0．1％BSA的PBS)懸浮細(xì)胞至106／lOOpL。室溫作用1h，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)和增加細(xì)胞膜的通透性。

取96孔塑料軟板或V型底離心管，每孔(管)加入20gL細(xì)胞，離心去上請(qǐng)。用懸浮液稀釋不含特異性抗體的同種抗體0．1mg／mL以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，同樣將未標(biāo)記的抗細(xì)胞因子的單抗稀釋至0．1mg／mL。分別于每孔(管)加入50gL同種抗體(為染色試驗(yàn)管)、未標(biāo)記抗體或含100～1 000倍量細(xì)胞因子的懸浮液(未標(biāo)記抗體或過(guò)量的細(xì)胞因子可以封閉特異性結(jié)合位點(diǎn)，作為陰性對(duì)照)。置室溫1h。

    5．染色與分析  加入熒光素標(biāo)記的抗細(xì)胞因子單抗，4~C作用30rain，用PBS-Ca-Mg洗滌細(xì)胞3次，將細(xì)胞懸浮于0．1％BSA-PBS中，進(jìn)行FCM分析。亦可同時(shí)加人不同熒光素標(biāo)記的抗細(xì)胞表面分子的單抗，與細(xì)胞作用后，可同時(shí)分析分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。