較高的保溫溫度有助于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對(duì)于多數(shù)RNA模板，在沒(méi)有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會(huì)存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。對(duì)這些困難模板的擴(kuò)增可以使用 ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，并將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)置于較高溫度下進(jìn)行以改善擴(kuò)增。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當(dāng)使用基因特異性引物(GSP)進(jìn)行cDNA合成時(shí)(見第三章)。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預(yù)計(jì)的保溫溫度相同。不要在高于60℃時(shí)使用oligo(dT)和隨機(jī)引物。隨機(jī)引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鐘。除了使用較高的逆轉(zhuǎn)錄溫度外，還可以通過(guò)直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉(zhuǎn)到逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，并加入預(yù)熱的2×的反應(yīng)混合物提高特異性(cDNA熱啟動(dòng)合成)。這種方法有助于防止較低溫度時(shí)所發(fā)生的分子間堿基配對(duì)。使用PCR儀可以簡(jiǎn)化 RT-PCR所需的多種溫度切換。

     Tth熱穩(wěn)定聚合酶在Mg2+存在條件下作為DNA聚合酶，在Mn2+存在條件下作為RNA聚合酶。它可以在最高65℃條件下保溫。然而，PCR過(guò)程中Mn2+的存在會(huì)降低忠實(shí)性，這使得Tth 聚合酶不太適合用于高精確度的擴(kuò)增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆轉(zhuǎn)錄效率較低，這會(huì)降低靈敏度，而且，既然單個(gè)酶就可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，那么沒(méi)有逆轉(zhuǎn)錄的對(duì)照反應(yīng)就不能用來(lái)將cDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物同污染的基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)分開來(lái)。