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金櫻子染料法PCR鑒定試劑盒引物設(shè)計基本原則:
1、引物長度:18-26bp,可放寬至18-30bp(有研究表明超過30bp再增加引物長度意義不大);
2、引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在;
3、引物Tm:54-58℃,可放寬至52~62℃,GC%>60%可進一步放寬;
4、擴增子Tm:>92℃;
5、3'端:優(yōu)選三聯(lián)體WSS、SWS、TTS,二連體GC,單體S,盡量規(guī)避WWW、CGW、GGG、CG;
6、引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有全互補序列,否則易導(dǎo)致非特異性擴增;
7)、末端2bp最好為GC;
8)、引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點,引入突變位點,用熒光物質(zhì)標記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等;
9)、其他:避免3'端8bp及以上序列與模板多位點互補,盡量避免上下游3'端4bp及以上反向互補,盡量避免內(nèi)部回文。
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