細胞凍存具體流程及注意事項：

1、預先配制凍存液：

凍存液比例多種，根據(jù)細胞的特性進行調(diào)整凍存液的比例：

5%—10%DMSO  +  20%—90%血清  +  0%—70%基礎培養(yǎng)液；

2、取對數(shù)生長期的細胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗1-2次；去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清；

3、加入適量yi 酶（濃度一般為0.25%），使yi 酶覆蓋整個瓶，放入培養(yǎng)箱消化；

4、細胞消化0.5-2min（具體時間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細胞，細胞胞質回縮，細胞間不再連接成片，此時加入*培養(yǎng)基終止消化；

5、用巴氏吸管輕輕吹打細胞，形成細胞懸液，將細胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min；

6、棄上清，加入適量預先配制好的凍存液，巴氏吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中的細胞最終密度為5×106/ml～1×107/ml；

7、將細胞分裝入凍存管中，每管1-1.5ml；

8、凍存管標記細胞名稱，凍存時間，操作者及細胞代數(shù)信息。

對于懸浮細胞凍存，則直接收集離心細胞，除去yi 酶消化的步驟，其他步驟相同。

注意事項:

1、需凍存保種的細胞應在生長良好且存活率高，其密度約為80-90％的狀態(tài)。細胞凍存前應保證細胞的活力好，無污染。

2、在細胞凍存過程中，所結的冰晶對細胞傷害較大，所以過程一定要慢。凍存或者復蘇最好用新配制的培養(yǎng)液。