歸納PCR引物的設(shè)計(jì)十條原則：
1、引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。
2、 產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
3、引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。
4、G+C含量在40%~60%之間。
5、堿基要隨機(jī)分布。
6、引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
7、引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
8、引物5′端可以修飾。
9、引物3′端不可修飾。
10、引物3′端要避開密碼子的第3位。
PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。
1、引物的特異性
引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。
2、避開產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)
某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。
3、長(zhǎng)度
寡核苷酸引物長(zhǎng)度為15~30bp，一般為20~27mer.引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2(G+C)+(A+T+，Ln值不能大于38，因?yàn)?gt;38時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過Taq DNA聚合酶的最適溫度(74℃)，不能保證產(chǎn)物的特異性。
4、G+C含量
G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。
5、堿基隨機(jī)分布
引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。
6、引物自身
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp.
7、引物之間
兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。
8、引物的3′端
引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反應(yīng)中，引物3′端不能發(fā)生錯(cuò)配。
在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP(四種dNTP各200μmol/L)以質(zhì)粒(103拷貝)為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯(cuò)七下降至1/100.引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的。
9、引物的5′端
引物的5′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物su、熒光、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。
10、密碼子的簡(jiǎn)并
如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。
