關(guān)于ELISA方面的知識你知道多少呢？隨小編一起來了解下ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作中的成敗細(xì)節(jié)吧！

ELISA試劑盒方法一：用于檢測未知抗體的間接法：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

試劑器材

1、試劑：

(1)包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液) : NaCO3 1.59克、NaHCO3 2.93克、加蒸餾水至1000ml

 (2)洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml

(3)稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗滌緩沖液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。

(4)終止液(2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。

(5)底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 檸檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸餾水50ml。

(6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩沖液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl

(7)ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩沖液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl

(8抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。

(9)正常人血清和陽性對照血清。

ELISA試劑盒方法二：用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法 :

1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。

2.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

4.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。

5.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。