蛋白免疫印跡樣本制備方法

1）融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的終濃度為1mM。

2）貼壁細胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。細胞充分裂解后應無沒有明顯的細胞沉淀。

懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成0.5-1×106個細胞/管，然后再裂解。

組織樣本：按照每20 mg組織加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。

3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

蛋白免疫印跡【注】：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等復合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。