進(jìn)口TSZ ELISA試劑盒反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)

復(fù)性溫度和時(shí)間：復(fù)性溫度決定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特異性，合適的復(fù)性溫度應(yīng)低于引物Tm值的5℃。退火溫度過(guò)低，引起非特異性擴(kuò)增；增高退火溫度，可提高擴(kuò)增的特異性，因此要嚴(yán)格規(guī)定退火溫度。退火反應(yīng)時(shí)間一般為1min。

在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)開(kāi)始的頭一次循環(huán)時(shí)，反應(yīng)從遠(yuǎn)低于Tm值的溫度開(kāi)溫，由于Taq酶在低溫時(shí)仍具有活性，這時(shí)就可能因引物與模板非特異性配對(duì)面出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物或出現(xiàn)引物二聚體 然后在以后整個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)中，非特異性產(chǎn)物反復(fù)擴(kuò)增，而使聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)嚴(yán)重失敗。為了盡量消除這種非特異性擴(kuò)增，可以使用熱起動(dòng)的方式，熱起動(dòng)方法有幾種：一種方法是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)系統(tǒng)中加入抗Taq酶抗體?？贵w與Taq酶結(jié)合，使Taq酶活性受抑制。因此在開(kāi)始時(shí)，雖然溫度低，引物可與與模板錯(cuò)配，但因Taq酶沒(méi)有活性，不會(huì)引起非特異性擴(kuò)增；當(dāng)進(jìn)行熱變性時(shí)，抗體在高溫時(shí)失活，Taq酶被釋放，就可發(fā)揮作用，在以后的延伸步驟進(jìn)行特異的DNA聚合反應(yīng)。另一種熱起動(dòng)法是用石蠟將Taq酶與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)系統(tǒng)分隔，因此一開(kāi)始在室溫條件下也沒(méi)有非特異性擴(kuò)增。當(dāng)升溫到熱變性溫度下，石蠟熔化，Taq酶與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反面系統(tǒng)混合，從而在以后的步驟中發(fā)揮作用。使用熱起動(dòng)可以提高聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的特異性。

延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度一般為72℃左右，此時(shí)Taq酶活性為每秒鐘摻入核苷酸35-100個(gè)，2kb的片段用1min已足夠，若DNA段較長(zhǎng)，擴(kuò)增時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又可引起非特異性擴(kuò)增。

循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)主要取決于初靶分子的濃度，例如在初始靶分子為3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷貝數(shù)時(shí)，循環(huán)數(shù)可分別為25-30、30-35、35-40從40-45。過(guò)多的循環(huán)次數(shù)會(huì)增加非特異性產(chǎn)物量及堿基錯(cuò)配數(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)后期，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加并不成為指數(shù)方式，稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)效應(yīng)可能與下列因素有關(guān)：dNTP與引物濃度降低，酶對(duì)模板的比例相對(duì)降低，多次循環(huán)后酶活力降低，產(chǎn)物濃度增高后變性不*而影響引物延伸。
變性溫度與時(shí)間：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)中變性這一步很重要，若不能使模板DNA和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物*變性，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反應(yīng)就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的變性溫度愈高。太高的變性溫度和時(shí)間又會(huì)影響Taq酶的活性，通常的變性溫度和時(shí)間分別為95℃、30s，有時(shí)用97℃、15s。雖然DNA鏈在變性溫度時(shí)兩鏈分離只需幾秒鐘，但反應(yīng)管內(nèi)部達(dá)到所需溫度還需要一定的時(shí)間，團(tuán)此要適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。為了保證模板DNA能*變性為7-10min，然后在以后的循環(huán)中，將變性步驟設(shè)為95℃/min。擴(kuò)增100-300bp短片段時(shí)，還呵以用快速的兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，即變性（94-97℃）、退火及延長(zhǎng)（55-75℃）。為防止在變性溫度時(shí)反應(yīng)液的蒸發(fā)，可在反應(yīng)管內(nèi)加入1-2滴液體石蠟。