溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時，產(chǎn)物的生成可達。    
進口ELISA試劑盒代測為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中放置一晚，以形成zui多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。    
若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應(yīng)如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。  
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標本和加酶結(jié)合物后。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。