在基因表達(dá)調(diào)控的研究中有各式各樣的方法，但究竟哪些方法應(yīng)用到哪些方向中呢?有相關(guān)人士根據(jù)過(guò)往經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合當(dāng)今核心常用技術(shù)，做了以下總結(jié)。

1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控——蛋白調(diào)控DNA的研究方法  ELISA試劑盒

1.1 啟動(dòng)子：基因序列中決定轉(zhuǎn)錄起始的部位。

1.1.1 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的確定

(1)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)TSS

①預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和啟動(dòng)子區(qū)域

②預(yù)測(cè)CpG島

(2)5’-RAce初步確定TSS的大概位置

(3)引物延伸、核酸酶保護(hù)或S1作圖定位TSS  ELISA試劑盒

1.1.2 啟動(dòng)子區(qū)域(順式作用元件)的確定

(1)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域

(2)克隆5’-flanking sequence，并連接到報(bào)告基因載體中

(3)缺失、突變

(4)熒光素酶活性分析

(5)確定轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域(啟動(dòng)子區(qū)域)

1.1.3 轉(zhuǎn)錄因子(反式作用元件)結(jié)合位點(diǎn)的確定

(1)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

(2)實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：EMSA，ChIP，DNase I足跡分析

1.1.4 反式作用元件和順式作用元件相互作用對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響

(1)定點(diǎn)突變：熒光素酶活性分析

(2)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子：測(cè)定目的基因的表達(dá)

(3)干擾轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)：測(cè)定目的基因的表達(dá)

(4)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

1.2 增強(qiáng)子：基因組中能增強(qiáng)鄰近基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的序列

(1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染——Luciferase熒光素酶法

(2)DNAase I hypersensitivity

(3)DNAase I footprinting/mutation analysis  ELISA試劑盒

(4)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

2 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控——蛋白調(diào)控RNA的研究方法

(1)RIP，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀法

(2)RNA-Protein Pull-Down技術(shù)

其中，ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase、生物信息學(xué)等為其中的核心技術(shù)，也是未來(lái)的主要研究方法趨勢(shì)。接下來(lái)，廣州賽誠(chéng)生物科技有限公司針對(duì)這些核心技術(shù)作進(jìn)一步介紹。

1 免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation analysis，ChIP)RNA是一種不穩(wěn)定的生物大分子, 絕大多數(shù)的 RNA都需要與特定的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA/蛋白復(fù)合物才能穩(wěn)定存在于細(xì)胞中; 不僅如此, RNA 與 RNA 結(jié)合蛋白之間的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)貫穿和伴隨了 RNA 的轉(zhuǎn)錄合成、加工和修飾、胞內(nèi)運(yùn)輸和定位、功能發(fā)揮及降解的整個(gè)生命循環(huán)。鑒于此, 利用 RNA 結(jié)合蛋白分離或發(fā)現(xiàn)鑒定功能性 RNA 分子是 RNA研究領(lǐng)域中一個(gè)*的研究方法。

RIP技術(shù)(RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀)，是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。運(yùn)用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行分析;即用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來(lái)，結(jié)合的RNA序列通過(guò)microarray(RIP-Chip)，定量RT-PCR或高通量測(cè)序(RIP-Seq)方法來(lái)鑒定。是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)。

簡(jiǎn)單地說(shuō), 就是利用 RNA結(jié)合蛋白的抗體免疫沉淀 RNA/蛋白復(fù)合物, 再?gòu)某恋淼?RNA/蛋白復(fù)合物中分離得到特定 RNA結(jié)合蛋白的 RNA; 分離得到的 RNA可以通過(guò)末端標(biāo)記和變性膠電泳對(duì) RNA 分子的大小進(jìn)行鑒定, 也可以利用高通量 RNA 測(cè)序方法對(duì) RNA 序列進(jìn)行分析。電流遷移率變動(dòng)分析又稱(chēng)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(electrophoresis mobility shift assay).是一種簡(jiǎn)單、快速和極為靈敏的體外檢測(cè)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，它可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的定性和定量分析，此外，也可以用于構(gòu)象變化的分析。  ELISA試劑盒

在EMSA實(shí)驗(yàn)中，純化的DNA特異結(jié)合蛋白或細(xì)胞粗提液和經(jīng)標(biāo)記的DNA或RNA探針一同溫育，在非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離蛋白質(zhì)——DNA復(fù)合物和游離的探針。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)——DNA復(fù)合物的遷移率主要取決于蛋白質(zhì)的大小、形狀、電荷和對(duì)稱(chēng)狀態(tài)，它的遷移速度要比游離的DNA慢得多，從而在凝膠上形成滯后帶。我們根據(jù)所顯示滯后帶的有無(wú)和量的多少，來(lái)反映DNA結(jié)合蛋白與DNA探針的結(jié)合活性、 DNA結(jié)合蛋白的表達(dá)水平，并可以計(jì)算出兩者的結(jié)合常數(shù)或解離常數(shù)。

凝膠遷移實(shí)驗(yàn)需要的結(jié)合蛋白，可來(lái)源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質(zhì)抽提液。還必須制備同位素標(biāo)記的DNA或RNA。結(jié)合反應(yīng)所需的組分有：含鹽的溶 化鎂，氯化鈉，或氯化鉀)、緩沖體系(Tris-HCl或HEPES)、還原劑( DTT)、甘油、非特異的競(jìng)爭(zhēng)DNA( poly(dI:dC)(dI:dC))，也可能含非離子去污劑。

EMSA結(jié)合反應(yīng)一般都要設(shè)置如下結(jié)合反應(yīng)： 1 ，陰性對(duì)照反應(yīng)(標(biāo)記探針); 2，常規(guī)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針); 3，探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針); 4，突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針); 5， Super-shift反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白+標(biāo)記探針+目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體)。

傳統(tǒng)的EMSA分析通常采用放射性同位素(如32p 3H)標(biāo)記的寡核苷酸探針，該方法雖靈敏性高、特異性強(qiáng)，但因同位素的半衰期短，且易于污染環(huán)境、危害身體等因素，在一般的實(shí)驗(yàn)室無(wú)法進(jìn)行，其應(yīng)用的廣泛性受到了極大的限制。目前，人們已采用了和生物素標(biāo)記的寡核苷酸來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的放射性同位素標(biāo)記的寡核苷酸，并在EMSA試驗(yàn)中獲得成功。同時(shí)基于EMSA的基礎(chǔ)上發(fā)展了超遷移率變動(dòng)分析 (supershift assay)和毛細(xì)管凝膠阻滯電泳，前者特異性要比EMSA好，常用于鑒定其他方法篩選出來(lái)的結(jié)果;后者樣品用量少、分辨率高，可用于一些受限制比較大的DNA——蛋白質(zhì)互作分析，如胚胎發(fā)育的研究過(guò)程。足跡試驗(yàn)的方法較多，常用的有DNase I足跡試驗(yàn)、*足跡試驗(yàn)(dimethylsulfate， DMS),二者原理基本相同,DNase I足跡法于1978年引入科研領(lǐng)域，其原理與DNA的化學(xué)測(cè)序法相似，首先將待測(cè)雙鏈DNA片段中一條鏈的一端選擇性地進(jìn)行標(biāo)記，然后加入恰當(dāng)濃度的DNaseI，使在DNA鏈上形成缺口，經(jīng)過(guò)變性后電泳分離，放射自顯影，即形成以相差一個(gè)核苷酸為梯度的DNA條帶。但當(dāng)DNA片段與相應(yīng)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后， DNA結(jié)合蛋白可保護(hù)相應(yīng)的DNA序列不受DNase I 的攻擊，因此在放射自顯影圖譜上， DNA梯度條帶在相應(yīng)的DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)域中斷，從而形成一空白區(qū)域，恰似蛋白質(zhì)在DNA上留下的足跡，因而被形象地稱(chēng)作足跡法。如果同時(shí)進(jìn)行DNA化學(xué)測(cè)序，即可判斷出結(jié)合序列的順序，該技術(shù)至今仍然是zui常用的方法，但是在實(shí)際應(yīng)用中，首先應(yīng)將序列特異蛋白進(jìn)行一定程度的純化，如硫酸銨分步沉淀，離子交換層析，凝膠過(guò)濾層析等，否則很難得到滿意的結(jié)果。因此在該足跡法的基礎(chǔ)上又發(fā)展了固相DNaseI足跡法，它具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)采用生物素進(jìn)行末端標(biāo)記，避免放射性同位素的摻人，減少危害; (2)省略了有機(jī)抽提、沉淀等蛋白純化步驟，操作簡(jiǎn)便，效率高; (3)使用范圍廣，可適用于未經(jīng)純化的核蛋白粗提物內(nèi)特異性DNA結(jié)合蛋白的研究。

常與EMSA法結(jié)合共同用于體外DNA——蛋白質(zhì)相互作用的鑒定，但二者的側(cè)重點(diǎn)不同. EMSA主要用于與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白的檢測(cè)，而DNase I足跡法在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證明了DNA元件和目標(biāo)蛋白的特異結(jié)合，并能告知與該蛋白結(jié)合的相應(yīng)DNA元件序列。