熒光定量PCR實驗指南
　　
　　一、基本步驟：
　　
　　1、目的基因(DNA和mRNA)的查找和比對；
　　
　　2、引物、探針的設(shè)計；
　　
　　3、引物探針的合成；
　　
　　4、反應(yīng)體系的配制；
　　
　　5、反應(yīng)條件的設(shè)定；
　　
　　6、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化；
　　
　　7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；
　　
　　8、標(biāo)準(zhǔn)品的制備；
　　
　　二、技術(shù)關(guān)鍵：
　　
　　1、目的基因(DNA和mRNA)的查找和比對；
　　
　　2、引物和探針設(shè)計
　　
　　2.1引物設(shè)計
　　
　　細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計是PCR中zui重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：
　　
　　²序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；
　　
　　²擴(kuò)增片段長度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別：
　　
　　sybrgreenI技術(shù)對片段長度沒有特殊要求；
　　
　　Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp－150bp；
　　
　　²避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；
　　
　　²避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；
　　
　　²典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
　　
　　²引物之間的TM相差避免超過2℃；
　　
　　²引物的3’端避免使用堿基A；
　　
　　²引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。
　　
　　²為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計能跨兩個外顯子。
　　
　　2.2Taqman探針設(shè)計一般設(shè)計原則：
　　
　　²探針位置盡可能地靠近上游引物；
　　
　　²探針長度通常在25－35bp，Tm值在65－70℃，通常比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。
　　
　　²探針的5’端應(yīng)避免使用堿基G。
　　
　　²整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。
　　
　　²為確保引物探針的特異性，將設(shè)計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。
　　
　　2.3TaqmanMGB探針設(shè)計介紹
　　
　　MGB探針的優(yōu)點：
　　
　　²MGB探針較短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。
　　
　　²短片段探針(14-20bp)加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達(dá)到熒光探針Tm值的要求。
　　
　　²MGB探針的設(shè)計原則
　　
　　²探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針?biāo)鉃閱蝹€堿基，與報告基團(tuán)相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號。
　　
　　²用primerexpress軟件評價Tm值，Tm值應(yīng)為65-67℃。
　　
　　²盡量縮短TaqmanMGB探針，但探針長度不少于13bp。
　　
　　²盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。
　　
　　²原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)。因此，在進(jìn)行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即TaqmanMGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點可向3’端移動，但突變位點至少在離3’端2個堿基的前方(即必須確保探針的后兩個堿基是的保守)，以進(jìn)行SNP檢測。反過來，若要進(jìn)行同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不*保守。有幾個突變，突變位點也應(yīng)靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號。另一種方法是設(shè)計簡并探針，也可達(dá)到即使是突變，仍可檢測到突變。
　　
　　2.4實時多重PCR探針的選擇：
　　
　　多重實時PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標(biāo)記探針，在檢測時可根據(jù)熒光的顏色來判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴(kuò)增不同長度的目的片段，反應(yīng)中加入SYBRN染料，zui后根據(jù)不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。
　　
　　多重實時PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時為Taqman探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon探針。
　　
　　在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析:
　　
　　設(shè)計好各對引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計的多重引物或兩兩分別選中所設(shè)計的多重探針后，在“report”菜單下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，并對此對引物用dG值進(jìn)行評價(通常給出zui差的dG值，理論上是dG值越大越好)。
　　
　　3、影響PCR及熒光PCR的其他因素
　　
　　引物的設(shè)計和選擇符合熒光PCR的探針并進(jìn)行設(shè)計對于實時熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計意味著的失敗。但是，好的設(shè)計并不等于好的實驗結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進(jìn)行介紹。
　　
　　3.1引物退火溫度
　　
　　引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度(Tm)。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5℃。
　　
　　設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機(jī)程序使用近鄰分析法——從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時可以如下進(jìn)行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得*結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
　　
　　3.2引物濃度
　　
　　引物的濃度會影響特異性。*的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了確定引物濃度，可以在260nm(OD260)測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)(nmol/OD)，通過Beers法則(公式1)計算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的濃度必須使用計算的消光系數(shù)。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數(shù)(OD/μmol)和消光系數(shù)的倒數(shù)(μmol/OD)。
　　
　　一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul(50μM)。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)(OD/μmol)，計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。
　　
　　濃度(μM)＝A260(OD/ml)×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)(nmol/OD)
　　
　　舉例：計算某寡核苷酸(溶于1ml水中)，取其中的10μl稀釋100倍(加入990μl)水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8nmol/OD，代入得：
　　
　　濃度＝0.2(OD/ml)×100×4.8(nmol/OD)＝96nmol/ml＝96μM
　　
　　3.3引物、探針的純度和穩(wěn)定性
　　
　　定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是因為DNA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。
　　
　　引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。在TE重溶引物，使其zui終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。
　　
　　引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫(15℃到30℃)僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫(15℃到30℃)zui多可以保存2個月。
　　
　　探針即寡核苷酸進(jìn)行熒光基團(tuán)的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間可以高達(dá)一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。
　　
　　由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，稀釋成2uM(10×)，作為工作濃度分裝多支，避光保存。
　　
　　3.4熱啟動
　　
　　熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性zui重要的方法之一。盡管TaqDNA聚合酶的*延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計的位點因為遺傳元件的定位而受*，如定點突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。
　　
　　限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能*抑制酶的活性，因此并不能*消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
　　
　　熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入TaqDNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。
　　
　　Transitor®HotStartTaq酶對于自動熱啟動PCR來說可靠。Transitor®HotStartTaq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴(kuò)增前，不會產(chǎn)生由于引物隨機(jī)粘連而形成的非特異性擴(kuò)增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團(tuán)會被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，酶活會被逐步釋放，有效提高擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。Transitor®HotStartTaqDNA聚合酶在變性步驟的95℃保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會被釋放到反應(yīng)中，從而*恢復(fù)聚合酶活性。
　　
　　3.5鎂離子濃度
　　
　　鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。*的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μMdNTP的實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液(普通PCR是1.5mM)。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實性。為了確定*濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用Transitor®HotStartTaq酶。Transitor®HotStartTaqDNA聚合酶能夠在比一般的TaqDNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。
　　
　　3.6模板質(zhì)量
　　
　　模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會抑制PCR。一些在標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時就會抑制擴(kuò)增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進(jìn)行PCR反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR反應(yīng)的成功率。
　　
　　3.7模板濃度
　　
　　起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴(kuò)增和熒光PCR擴(kuò)增，104到106個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線(或在溴化乙錠染色膠上觀察到)。所需的*模板量取決于基因組的大小(下表)。舉例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相當(dāng)于3×104到3×105個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10－100ng的量就足夠檢測了。當(dāng)然對模板做一個梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴(kuò)增效率。
　　
　　表1.基因組大小和分子數(shù)目的比例
　　
　　基因組DNASize(bp)*TargetMolecules/µgofGenomicDNAAmountofDNA(µg)for-10^5Molecules
　　
　　E.coli4.7×10^61.8×10^80.001
　　
　　Saccharomycescerevisiae2.0×10^74.5×10^70.01
　　
　　Arabidopsisthaliana7.0×10^71.3×10^70.01
　　
　　Drosophilamelanogaster1.6×10^86.6×10^50.5
　　
　　Homosapiens2.8×10^93.2×10^51.0
　　
　　Xenopuslaevis2.9×10^93.1×10^51.0
　　
　　1.0Musmusculus3.3×10^92.7×10^51.0
　　
　　Zeamays1.5×10^106.0×10^42.0
　　
　　pUC18plasmidDNA2.69×10^33.4×10^111×10^(-6)
　　
　　3.8防止殘余(Carry-over)污染
　　
　　PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源(非殘余污染)。
　　
　　可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫φ諜z測污染。
　　
　　使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨加入。
　　
　　一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。這種酶(也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG)移除DNA中的尿嘧啶。在擴(kuò)增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因為前面的擴(kuò)增產(chǎn)物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。
　　
　　4、高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系
　　
　　影響PCR的因素如此之多，您有時很難區(qū)分是什么導(dǎo)致您的實驗結(jié)果不佳。降低實驗的不穩(wěn)定因素是使用可靠的產(chǎn)品。
　　
　　使用、性能可靠的熱啟動酶、的dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預(yù)混成的定量PCR試劑體系，zui大程度的降低了反應(yīng)變量，提高了實驗的可重復(fù)性和可靠性。您還需要進(jìn)行以下步驟的準(zhǔn)備：設(shè)計引物和探針、合成引物和探針、正確儲藏、得到高質(zhì)量的模板，隨后，您僅需要進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，就能得到好的實驗結(jié)果。
　　
　　FQPCRMASTERMix-UDG(hotstart)同競爭對手的定量PCR體系相比提供了更優(yōu)異的結(jié)果。使用這種產(chǎn)品，您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度，同時可以靈活地選擇您所喜歡的擴(kuò)增條件，檢測方法和設(shè)備。
　　
　　實時定量PCR是快速增長的PCR方法，它可以、可重復(fù)地定量起始物質(zhì)。FQPCRMASTERMix-UDG(hotstart)是一種方便使用的反應(yīng)混合液，為定量分析進(jìn)行了優(yōu)化。它包含了熒光PCR所必須的成分(如緩沖液，dNTP，聚合酶)。只需加入您的模板，擴(kuò)增引物和熒光標(biāo)記探針。您就可以得到實時qPCR所需的特異性和靈活性。
　　
　　高產(chǎn)量和特異性的擴(kuò)增
　　
　　FQPCRMASTERMix-UDG(hotstart)提供了強(qiáng)大的PCR擴(kuò)增，可以使用多個模板組。所使用的TaqDNA聚合酶具有熱啟動特性。這極大地降低和消除了錯誤配對和非特異性擴(kuò)增，使您得到較高產(chǎn)量，并增加特異性。整合的UDG(尿苷酸DNA糖基化酶)防止殘余污染的能力防止了非模板DNA的擴(kuò)增，從而降低了假陽性，使結(jié)果更可靠。
　　
　　在產(chǎn)量和靈敏度方面，QuantitativePCRMASTERMix-UDG(hotstart)的靈敏度*(閾循環(huán))。您可以更地定量低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范圍內(nèi)檢測線性劑量反應(yīng)。
　　
　　高度靈活性
　　
　　除了靈敏度和特異性外，UniversalPCRMasterMixKit在分析設(shè)置，檢測方法和設(shè)備上給您提供了較高的自由度。使用UniversalPCRMasterMixKit，您可以：
　　
　　對擴(kuò)增的不同模板優(yōu)化鎂離子濃度，由于提供了附加的氯化鎂，所以您可以方便地配置Mix體系。
　　
　　可以更靈活的進(jìn)行普通PCR和熒光PCR。
　　
　　可以在多種設(shè)備上使用，如ABIPrism®7700,ABIGeneAmp®5700和Bio-Rad的I-Cycler。
　　
　　可以利用多種檢測方法的優(yōu)點，包括TaqMan®探針和MolecularBeacon，您不必局限于特定的試劑盒。
　　
　　5、反應(yīng)體系配制
　　
　　ðA2010A0101試劑盒：(探針體系)
　　
　　FQ-PCRMasterMix-UNG混合物(2X)25ul(終濃度為1×)；
　　
　　上游引物(終濃度為50~900nM)，下游引物(終濃度為50~900nM)；
　　
　　探針(終濃度為200nM)；
　　
　　待檢樣品5ul(終濃度為10~100ng)；
　　
　　無菌去離子水補(bǔ)足，使總體積達(dá)到50ul。
　　
　　ðA2010A0106試劑盒:
　　
　　反應(yīng)體系終濃度：
　　
　　1-2U的hotstartTaq酶、2.5-4.0mM的Mg2+、0.2－0.4mM的dNTPs、1×PCRbuffer(A2010A0106)；50－900nM的上游引物、50－900nM的下游引物、200nM的探針、通常取2-5ul的模板,反應(yīng)總體積通常為20－50ul
　　
　　ð自配熱啟動熒光－UNG體系：
　　
　　1-2U的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5-4.0mM的Mg2+(A2010A0104)；0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)、0.2－0.4mM的d(A,C,G)TPs、0.3-0.6mMdUTP(A2010A0108)；50－900nM的上游引物、50－900nM的下游引物、200nM的探針、通常取2-5ul的模板、反應(yīng)總體積通常為20－50ul
　　
　　6、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化
　　
　　使用高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系FQPCRMASTERMix-UDG(hotstart)，zui大程度降低了需要優(yōu)化的參數(shù)。您只需要優(yōu)化退火溫度，就可以得到更靈敏、更可靠的定量結(jié)果。對于特殊結(jié)構(gòu)的熒光PCR，您可以優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更靈敏的結(jié)果。
　　
　　使用通用PCRMasterMix試劑盒進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，可以適合更多的反應(yīng)體系，如mRNA的普通RT-PCR檢測，適用于合成質(zhì)粒的PCR，同時也適用于熒光PCR，范圍更寬。
　　
　　采用成套的hotstartTaq酶，您需要對酶量、鎂離子濃度、UNG濃度、dUTP濃度、引物濃度、退火溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化(參照3：影響PCR及熒光PCR的其他因素)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的指標(biāo)越多，實驗的不確定性就越大。避免在操作中引入更大的不確定性和不可重復(fù)性。注意：同樣可參照的QPCRMASTERMix-UDG(hotstart)使用注意事項。
　　
　　7、疑難解答
　　
　　問題可能原因建議解決方法
　　
　　定量PCR無擴(kuò)增產(chǎn)量或很少的擴(kuò)增產(chǎn)量DNA模板質(zhì)量不好，含有抑制劑提高模板質(zhì)量，諸如DMSO，SDS和甲酰胺之類的試劑會抑制TaqDNA聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA
　　
　　PCR引物設(shè)計較差避免在引物3'端含有互補(bǔ)序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計Tm類似的引物。
　　
　　探針設(shè)計較差對探針序列進(jìn)行blast比對，設(shè)計符合要求的探針
　　
　　PCR引物合成較差用普通電泳法，看引物的設(shè)計和合成質(zhì)量，是否有目的條帶出現(xiàn)。
　　
　　熒光探針無功能確保探針設(shè)計的有效性和fluorophore和quencher的存在。
　　
　　用DNase處理TaqMan探針，校驗熒光是否增強(qiáng)。
　　
　　必要的話設(shè)計和合成探針。
　　
　　模板濃度太低使用10^4拷貝的靶序列，以在25到30個循環(huán)中獲得信號。
　　
　　鎂離子濃度太低從3mM到5mM，間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對于每個模板和引物對的*鎂離子濃度。FQ-PCRMasterMix-UNG試劑盒不需優(yōu)化鎂離子濃度。
　　
　　引物濃度太低*引物濃度介于0.1μM到0.5μM之間。為了確定引物濃度，在260nm測量光密度，然后使用光吸收值和消光系數(shù)計算濃度。(見公式1)
　　
　　選擇酶進(jìn)行擴(kuò)增選擇hotstartTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增，可提高靈敏度，增加產(chǎn)量，降低干擾因素
　　
　　退火溫度太高使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設(shè)定為低于Tm5℃。因為這些公式只是估算Tm值，所有真正的退火溫度實際會高些或低些。
　　
　　反應(yīng)物中有不明物干擾在各個反應(yīng)物中存在不明物質(zhì)對PCR進(jìn)行干擾，對任何實驗樣品或試劑，均應(yīng)采用無菌無酶無熱源的離心管進(jìn)行試劑的分裝和使用。
　　
　　定量PCR陽性對照無擴(kuò)增曲線(針對：已經(jīng)優(yōu)化好的體系)引物、探針設(shè)計合格；原來合成質(zhì)量已經(jīng)驗證。需確認(rèn)：反應(yīng)成分是否漏加；確定反應(yīng)條件是否合適；
　　
　　正常標(biāo)本是否能擴(kuò)增來判斷是對照的問題還是體系的問題；
　　
　　確認(rèn)體系：1、引物是否降解(看擴(kuò)增產(chǎn)物是否可電泳出)來判斷引物和酶功能；2、探針是否降解(用DNase處理TaqMan探針，校驗熒光是否增強(qiáng))。
　　
　　儀器是否正常工作
　　
　　定量PCR陰性對照一直有擴(kuò)增曲線模板或PCR殘余污染隔離污染來源，更換試劑。
　　
　　使用UNG/dUTP防污染系統(tǒng)。
　　
　　使用的精致移液器。
　　
　　在無DNA區(qū)域準(zhǔn)備反應(yīng)，使用抗氣溶膠的吸頭。
　　
　　體系有問題酶濃度不對，Mg離子濃度不對
　　
　　定量PCR(染料法)出現(xiàn)非特異信號引物二聚體多檢查引物設(shè)計和合成環(huán)節(jié)，必要時更改引物
　　
　　更換熱啟動酶熱啟動酶能增加反應(yīng)的特異性，提高靈敏度
　　
　　設(shè)定檢測信號時的溫度在更高的溫度下檢測熒光信號(此時引物二聚體已經(jīng)解鏈)
　　
　　定量RT-PCR
　　
　　無擴(kuò)增產(chǎn)量
　　
　　相對熒光信號小于等于背景或沒有模板對照無cDNA合成
　　
　　cDNA合成溫度太高降低保溫溫度
　　
　　反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物被二級結(jié)構(gòu)封閉提高保溫溫度。重新設(shè)計引物
　　
　　RNA被損害或降解必要的話更換RNA
　　
　　RNAse污染維持無菌條件；加入RNase抑制劑
　　
　　熒光探針無功能確保探針設(shè)計的有效性和fluorophore和quencher的存在。
　　
　　用DNase處理TaqMan探針，校驗熒光是否增強(qiáng)。
　　
　　必要的話設(shè)計和合成探針。
　　
　　靈敏度低
　　
　　須在比預(yù)期更高的循環(huán)中檢出產(chǎn)物(Ct滯后)初始模板RNA不充分增加模板RNA的濃度；使用10ng-1µg的總RNA
　　
　　RNA被損害和降解必要的話更換RNA
　　
　　RNAse污染維持無菌條件；加入RNase抑制劑
　　
　　無效的cDNA通過增加70％乙醇清洗的次數(shù)來去除制備RNA過程中的抑制劑
　　
　　無效的PCR擴(kuò)增注意：反轉(zhuǎn)錄的抑制劑包括SDS、EDTA、胍鹽、甲酰胺、磷酸鈉和亞精胺。
　　
　　調(diào)整cDNA合成溫度或引物設(shè)計
　　
　　檢測使用儀器擴(kuò)增儀溫度檢查和熒光儀器溫度和信號檢查，是整體滯后還是個別孔滯后
　　
　　PCR忠實性：PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯誤采用熒光探針法增加結(jié)果特異性和產(chǎn)物的忠實性
　　
　　循環(huán)數(shù)太多降低循環(huán)數(shù)。
　　
　　四種dNTP的濃度不同制備新的dNTP混合物，保證四種核苷濃度相同。使用預(yù)混合物。
　　
　　其他問題：
　　
　　1)、文獻(xiàn)上找到的引物和探針序列能否直接使用？
　　
　　通常國外的文獻(xiàn)可信度比較高，可直接使用；但為了保險起見，用blast對引物探針的序列進(jìn)行必要的驗證；或者再進(jìn)一步用primer軟件對引物探針的二級結(jié)構(gòu)和退火溫度進(jìn)行分析，這樣更有利于您對整個實驗的把握。
　　
　　2)、在實驗之前要進(jìn)行哪些準(zhǔn)備工作？
　　
　　首先要不加探針做常規(guī)的PCR實驗，驗證引物是否工作、模板是否降解、模板純度是否合適，可以采用《通用PCRMasterMix試劑盒》來縮短該過程。
　　
　　3)、標(biāo)本的采集和處理應(yīng)該注意什么問題？
　　
　　根據(jù)實驗要求和目的，有針對性采集病灶部位的標(biāo)本；采集好的標(biāo)本，根據(jù)每次實驗用量，用凍存管分成幾小份，放在－80℃保存，以免反復(fù)凍融；標(biāo)本通常分成3類，如細(xì)胞組織、分泌物、血清全血；如果是血清，不能有融血現(xiàn)象的發(fā)生，否則會影響PCR的擴(kuò)增；如果是全血，不用EDTA作為抗凝劑，選用檸檬酸作為抗凝劑，否則會影響PCR的擴(kuò)增；如果是組織，用蛋白酶K消化；如果是提RNA的標(biāo)本，更應(yīng)該防止反復(fù)凍融和保持標(biāo)本的新鮮。
　　
　　4)、在做熒光定量實驗時要注意些什么呢？
　　
　　見產(chǎn)品操作注意事項。
　　
　　5)、如果出現(xiàn)污染該怎么辦？
　　
　　以替換法確定污染從何而來，對癥下藥，值得注意的是，因熒光定量PCR的敏感度*，從防止污染的角度出發(fā)，在體系中加有dUTP，一旦出現(xiàn)污染現(xiàn)象，可以用UNG酶消除；同時將實驗室分成4個區(qū)，即試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)。