大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)zui突出的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單、產(chǎn)量高、成本低。然而，許多蛋白質(zhì)在翻譯后，需經(jīng)過翻譯后的修飾加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等過程才能轉(zhuǎn)化成活性形式。大腸桿菌缺少上述加工機(jī)制，不適合用于表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)。另外，蛋白質(zhì)的活性還依賴于形成正確的二硫鍵并折疊成結(jié)構(gòu)，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)往往不能進(jìn)行正確的折疊，是以包含體狀態(tài)存在。包含體的形成雖然簡化了產(chǎn)物的純化，但不利于產(chǎn)物的活性，為了得到有活性的蛋白，就需要進(jìn)行變性溶解及復(fù)性等操作，這一過程比較繁瑣，同時(shí)增加了成本。
與大腸桿菌相比，酵母是低等真核生物，具有細(xì)胞生長快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡單等原核生物的特點(diǎn)，又具有真核生物時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工，修飾，合理的空間折疊等功能，非常有利于真核基因的表達(dá)，能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白翻澤后加工、修飾的不足。因此酵母表達(dá)系統(tǒng)受到越來越多的重視和利用。
大腸桿菌是用得zui多、研究zui成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)前已商業(yè)化的基因工程產(chǎn)品大多是通過大腸桿菌表達(dá)的，其主要優(yōu)點(diǎn)是成本低、產(chǎn)量高、易于操作。但大腸桿菌是原核生物，不具有真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)的加工修飾能力，其產(chǎn)物往住形成沒有活性的包涵體，需要經(jīng)過變性、復(fù)性等處理，才能應(yīng)用。近年來，以酵母作為工程菌表達(dá)外源蛋白日益引起重視，主更是因?yàn)榻湍甘菃渭?xì)胞真核生物，不但具有大腸桿菌易操作、繁殖快、易于工業(yè)化的特點(diǎn)，還具有真核生物表達(dá)系統(tǒng)基因表達(dá)調(diào)控和蛋白修飾功能，避免了產(chǎn)物活性低，包涵體變性、復(fù)性等等間題。
與大腸桿菌相比，酵母是單細(xì)胞真核生物，具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，人們對釀酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遺傳學(xué)方面的認(rèn)識zui早，釀酒酵母也zui先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主。1981年釀酒酵母表達(dá)了*個外源基因一干擾素基因，隨后又有一系列外源基因在該系統(tǒng)得到表達(dá)。雖然干擾素和胰島素已大量并在人群中廣泛應(yīng)用，但很大部分表達(dá)由實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)展到工業(yè)規(guī)模時(shí)，培養(yǎng)基中維特質(zhì)粒高拷貝數(shù)的選擇壓力消失，質(zhì)粒變得不穩(wěn)定，拷貝數(shù)下降，而大多數(shù)外源基因的表達(dá)需要高拷貝數(shù)的維特，因此引起產(chǎn)量下降。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室用培養(yǎng)基復(fù)雜而昂貴，采用工業(yè)規(guī)模能夠接受的培養(yǎng)基時(shí)，往往導(dǎo)致產(chǎn)量的下降。為克服釀酒酵母的局限，人們發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母（methylotrophic yeast）為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。
甲基營養(yǎng)型酵母包括：Pichia、Candida等。以Pichia.pastoris（畢赤巴斯德酵母）為宿主的外源基因表達(dá)系統(tǒng)近年來發(fā)展zui為迅速，應(yīng)用也，已利用此系統(tǒng)表達(dá)了一系列有重要生物學(xué)活性的蛋自質(zhì)。畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，原因在于該系統(tǒng)除了具有一般酵母所具有的特點(diǎn)外，還有以下幾個優(yōu)點(diǎn)；
⑴ 具有醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前zui強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理zui嚴(yán)格的啟動子之一。
⑵ 表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合。
⑶ 菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高。
⑷ 畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細(xì)胞的毒害作用。
Pichia.pastoris基因表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，表達(dá)基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌并適當(dāng)糖基化，培養(yǎng)方便經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。利用強(qiáng)效可調(diào)控啟動子AOX1，已表達(dá)了HBsAg、TNF、EGF、破傷風(fēng)毒素 C片段、基因工程抗體等多種外源基因，證實(shí)該系統(tǒng)為、實(shí)用、簡便，以提高表達(dá)量并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性為突出特征的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，而且非常適宜子擴(kuò)大為工業(yè)規(guī)模。目前美國FDA已能評價(jià)來自該系統(tǒng)的基因工程產(chǎn)品，zui近來自該系統(tǒng)的Cephelon制劑已獲得FDA批準(zhǔn)，所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的。 Pichia.pastoris表達(dá)系統(tǒng)在生物工程領(lǐng)域?qū)l(fā)揮越來越重要的作用，促進(jìn)更多外源基因在該系統(tǒng)的表達(dá)，提供更為廣泛的基因工程產(chǎn)品。
近年來，Invitrogon公司開發(fā)了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品，短短幾年已經(jīng)有300多種外源蛋自在該系統(tǒng)得到有效表達(dá)，被認(rèn)為是目前zui有效的酵母表達(dá)系統(tǒng)。
畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標(biāo)記。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點(diǎn)彼ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。
Pichia.pastoris酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，將外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。包括啟動子、外源基因克隆位點(diǎn)、終止序列、篩選標(biāo)記等。表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌復(fù)制擴(kuò)增，然后被導(dǎo)入宿主酵母細(xì)胞。為使產(chǎn)物分泌胞外，表達(dá)載體還需帶有信號肽序列。
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)有多種分泌型表達(dá)質(zhì)粒，有許多蛋白在畢赤酵母得到了分泌表達(dá)。胞外表達(dá)需要在外源蛋白的N末端加上一段信號肽序列，引導(dǎo)重組蛋白進(jìn)入分泌途徑，可使蛋白蛋白質(zhì)在分泌到胞外之后獲得準(zhǔn)確的構(gòu)型。畢赤酵母對外源蛋白自身的信號序列識別能力差，在本試驗(yàn)中所使用pPICZαA質(zhì)粒，其信號肽來自釀酒酵母的α-交配因子（α-factor），能很好的達(dá)到以上的要求。并且作為新一代的畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒，它還擁有一個特點(diǎn)是其具有Zeocin抗性標(biāo)記基因，給我們篩選轉(zhuǎn)化子的工作帶來很大的便利。
pPICZαA質(zhì)粒是作為新一代的畢赤酵母分泌表達(dá)質(zhì)粒，它的主要特點(diǎn)簡介如下：
⑴ 具有強(qiáng)效可調(diào)控啟動子AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）；
⑵ 具有Zeocin抗性篩選標(biāo)記基因，重組轉(zhuǎn)化子可直接用Zeocin進(jìn)行篩選，即在YPDZ平板上生長的轉(zhuǎn)化子中，100％都有外源基因的整合，大大簡化了重組轉(zhuǎn)化酵母的篩選過程。在操作過程中，Zeocin也可用來篩選含表達(dá)載體pPICZαA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，不必另外使用Amp，經(jīng)濟(jì)而又簡便。
⑶ 在表達(dá)載體A0X1 5’端啟動子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，多克隆位點(diǎn)下游有A0X1 3’端終止序列；http://www.duty-free.cn/Login/default.aspx?Stand_DownLoadOperate
⑷ 分泌效率強(qiáng)的信號肽α-factor。
Invitrogen公司開發(fā)的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的系列產(chǎn)品作為目前被應(yīng)用為的酵母表達(dá)系統(tǒng)，其主要的優(yōu)點(diǎn)有：醇氧化酶可調(diào)控的強(qiáng)啟動子，能高密度發(fā)酵，重組蛋白表達(dá)量高。外源基因整合在酵母基因組上，可以穩(wěn)定存在。同時(shí)，分泌表達(dá)質(zhì)粒能將外源蛋白表達(dá)后，進(jìn)行翻譯后加工處理，將外源蛋白分泌到細(xì)胞外，不但提高表達(dá)蛋白的活性，而且。有利于產(chǎn)物的純化。